DBP和TPP聯合暴露對斑馬魚胚胎發育的影響

張明君 戶沙沙 姜偉偉 李艷 孫桂金

摘要 [目的]研究鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和磷酸三苯酯（TPP）單獨及聯合暴露對斑馬魚胚胎發育的影響。[方法]將受精后4 hpf（hour post-fertilization，hpf）斑馬魚胚胎分別暴露于DBP（0、0.5和1.0 mg/L）、TPP（0和0.5 mg/L）和TPP+DBP（0.5 mg/L+0.5 mg/L和0.5 mg/L+1.0 mg/L），統計72 hpf胚胎孵化率以及96 hpf仔魚存活率、孵化率、畸形率和體長。[結果]DBP和TPP單獨及聯合暴露引起斑馬魚卵黃囊腫、心臟畸形、脊柱彎曲和尾巴畸形，導致斑馬魚孵化率和存活率下降、畸形率增加和體長縮短。[結論]DBP和TPP聯合暴露對斑馬魚存活率、畸形率和體長影響存在交互作用，對孵化率的影響無交互作用。

關鍵詞 DBP;TPP;聯合暴露;斑馬魚胚胎;發育

中圖分類號 S 917.4? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Combined Exposure to DBP and TPP on the Development of Zebrafish （Danio rerio） Embryos

ZHANG Ming-jun，HU Sha-sha，JIANG Wei-wei et al （School of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），Jinan，Shandong 250000）

Abstract [Objective]To study the effect of individual and combined exposure to dinbutyl phthalate （DBP） and triphenyl phosphate （TPP） on the development of zebrafish embryos.[Method]Zebrafish embryos at 4 hpf（hour post-fertilization，hpf） were exposed to DBP （0，0.5 mg/L and 1.0 mg/L），TPP （0 and 0.5 mg/L） and TPP+DBP （0.5 mg/L+0.5 mg/L and 0.5 mg/L+1.0 mg/L）.The hatching rate of zebrafish embryos was recorded at 72 hpf，and the survival rate，hatching rate，malformation rate and body length of zebrafish larvae were recorded at 96 hpf.[Result]Exposure to individual and combined of DBP and TPP resulted in obvoius malformations in zebrafish，including yolk-sac edema，cardiac deformities，spinal curvature and tail malformation，decreased hatching and survival rates，increased malformation rate and reduced body length in zebrafish embryos.[Conclusion]It has an interaction effect on the survival rate，malformation rate and body length of zebrafish，and no interaction on the hatching rate of zebrafish.

Key words DBP;TPP;Combined exposure;Zebrafish embryos;Development

基金項目 國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201910431048）。

作者簡介 張明君（1997—），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事食品毒理學研究。

收稿日期 2021-05-30

鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalates，PAEs）由于具有軟化塑料和增強塑料彈性的特點，已廣泛應用于食品包裝、醫療器械、個人護理用品、玩具、清潔劑、潤滑油等，是一類生產量大的人工合成化合物，是目前全球最常用的塑化劑。隨著時間的推移，PAEs不斷釋放至環境，空氣、土壤和水均受到 PAEs的污染[1-2]。人體血液、尿液和母乳等體液也檢出了PAEs及其代謝物[3-4]。PAEs及其代謝物不僅具有生殖和發育毒性，而且存在致癌、致畸、致突變的潛在毒性，嚴重影響人類的健康[5-6]。阻燃劑是一類能夠防止材料被引燃或者抑制火焰傳播的助劑，由于溴代阻燃劑在環境中具有持久性、生物蓄積性等特點，在世界范圍內被逐步禁用。有機磷阻燃劑（organophosphate flame retardants，OPFRs）價格較便宜，并具有良好的阻燃效果，且兼有增塑等功能，在紡織、化工、建材和電子等行業廣泛應用，水、大氣、土壤及生物體均受到OPFRs的污染[7]。人體尿液、血漿、頭發、母乳等人體樣本中也檢測出了OPFRs[8-9]。OPFRs具有發育毒性、神經毒性、生殖毒性、心臟毒性、肝臟毒性等[7，10]，給生態環境和人類健康造成潛在威脅。 PAEs和OPFRs在環境中同時存在，人類面臨同時暴露PAEs和OPFRs的風險。單獨評價PAEs和OPFRs毒性作用不能反映它們在環境中的真實毒性效應，而聯合毒性作用的研究更有助于客觀地評價它們在環境中的真實毒性效應，目前關于兩者聯合毒性作用的研究數據仍較為有限。

鄰苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DBP）是目前使用最普遍的PAEs之一，大氣、水體、土壤和生物體中均發現了它的存在[11-12]。磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPP）是典型的 OPFRs 之一，生產和需求量都相當高，在多種環境介質以及生物體內均有檢出[13-15]。研究者已對DBP和TPP的單一毒性進行了深入研究[11-15]，而兩者聯合毒性作用的研究鮮見報道。斑馬魚是一種常見的熱帶淡水魚，具有體型小、飼養管理容易、飼養成本低、體外受精和發育、繁殖周期短、產卵量大、胚胎透明、基因組與人類基因組有高度的同源性等特點，已成為繼小白鼠后的第二大模式生物，廣泛應用于發育學、毒理學和疾病研究中[16]。該研究以斑馬魚胚胎作為受試對象，探討DBP和TPP單獨及聯合暴露對其發育的影響，可為PAEs和OPFRs聯合毒性的研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑? DBP（CAS 號：8474- 純度99%）、TPP （CAS號：115-86-6，純度≥99%）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DBP和TPP溶解于DMSO配制成儲液，4 ℃ 保存。苯硫脲（phenylthiourea，PTU，CAS號：103-85-5，純度≥98%）購自美國 Sigma 公司;DMSO、NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3 均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚胚胎收集。試驗用AB品系斑馬魚，購自上海費曦生物科技有限公司，參照《The Zebrafish Book》[17]對斑馬魚進行飼養和繁殖。試驗前1 d晚上按雌雄1∶2比例將成年斑馬魚放入排卵缸內，并將雌雄斑馬魚用隔板分開。第2天早上拆除隔板進行光照，光照 1 h 后在顯微鏡下觀察挑選發育正常的胚胎放入培養液（3.5 g/L NaCl、0.5 g/L KCl、0.1 g/L CaCl2、0.025 g/L NaHCO3）中培養至4 hpf（hour post fertilization，hpf），用于后續試驗。

1.2.2 試驗設計。試驗分為6組，每個試驗組 DMSO 含量0.001%（體積分數），各試驗組的暴露劑量見表1。

1.2.3 DBP和TPP單獨及聯合暴露。

挑選健康4 hpf 的斑馬魚胚胎隨機放入試驗組，每組35個胚胎。選用玻璃培養皿，每個培養皿放入暴露液5 mL，每皿35個胚胎，恒溫光控培養箱中（溫度控制在28 ℃，光照/黑暗周期14 h/10 h）培養。24 hpf 后斑馬魚胚胎暴露液中加入0.003% PTU抑制黑色素生長，每天更換暴露液，并棄去死亡的胚胎，連續培養至96 hpf，試驗重復 3 次。觀察并記錄各組96 hpf斑馬魚表型，72 和96 hpf 斑馬魚孵化數，96 hpf 斑馬魚存活數、畸形數和體長。

1.3 數據分析 采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性檢驗通過LSD（Fishers least significant difference）法比較，所有結果均表示為平均值±標準差（±SD），P<0.05 為顯著性差異。析因設計方差分析判斷是否存在交互作用，P<0.05 表示存在交互作用。

2 結果與分析

2.1 DBP和TPP單獨及聯合暴露對斑馬魚仔魚存活率的影響

從圖1可以看出，與對照組相比，DBP和TPP單獨及聯合暴露均顯著降低斑馬魚仔魚存活率;與DBP 組相比，DBP和TPP聯合暴露顯著降低斑馬魚仔魚的存活率;與TPP組相比，TPP+DBP-H 組斑馬魚仔魚的存活率顯著降低。雙因素方差分析表明，DBP和 TPP 聯合暴露對斑馬魚仔魚存活率的影響存在交互作用。

2.2 DBP和TPP單獨及聯合暴露對斑馬魚孵化率的影響

從DBP和TPP單獨及聯合暴露對斑馬魚胚胎和仔魚孵化率的影響（圖2、3）可以看出，與對照組相比，DBP-H及TPP+DBP-H組72 hpf 斑馬魚胚胎的孵化率顯著降低;與TPP組相比，TPP+DBP-H組胚胎的孵化率顯著降低。與對照組相比，TPP+DBP-H組 96 hpf 斑馬魚仔魚的孵化率顯著降低;與TPP組相比，TPP+DBP-H組 96 hpf 斑馬魚仔魚的孵化率顯著降低。雙因素方差分析表明，DBP和TPP聯合暴露對斑馬魚仔魚孵化率的影響無交互作用。

2.3 DBP和TPP單獨及聯合暴露對斑馬魚仔魚致畸效應的影響 DBP和TPP 單獨暴露均引起斑馬魚卵黃囊腫、心包水腫、脊柱彎曲和尾巴畸形，這與前人的研究結果相同[18-20]。DBP和TPP聯合暴露引起的斑馬魚毒性表型與DBP和TPP 單獨暴露引起的斑馬魚毒性表型相同。從圖4可以看出，與對照組相比，DBP和TPP單獨及聯合暴露組（0.5 mg/L DBP除外）斑馬魚仔魚畸形率顯著增加;與DBP組相比，DBP和TPP聯合暴露導致斑馬魚仔魚畸形率顯著增高;與TPP組相比，DBP和TPP聯合暴露導致斑馬魚仔魚畸形率顯著增高。雙因素方差分析表明，DBP 和 TPP聯合暴露對斑馬魚仔魚畸形率的影響存在交互作用。

2.4 DBP和 TPP單獨及聯合暴露對斑馬魚仔魚體長的影響

從圖5可以看出，與對照組相比，DBP-H及DBP和TPP聯合暴露顯著降低斑馬魚仔魚體長;與DBP組相比，TPP和DBP聯合暴露顯著降低斑馬魚仔魚體長;與TPP組相比，TPP+DBP-H組斑馬魚仔魚體長顯著降低。雙因素方差分析表明，DBP和 TPP聯合暴露對斑馬魚仔魚體長的影響有交互作用。

3 討論與結論

我國的大氣、土壤和水源都受到了不同程度的污染，環境污染已經達到非常嚴重程度。為保護人類健康，各國科學家已經對環境污染物進行了一系列研究，以前的大多數研究主要集中在單一毒性效應，聯合毒性效應研究較少。而在實際環境中，環境污染物均以混合物的形式存在，污染物聯合毒性的評估在理論和應用方面都具有越來越重要的科學意義和實際價值。2013年，美國NIEHS就指出應以闡明環境混合物的健康效應作為其未來優先研究重點之一[21]。聯合毒性作用的研究是當前環境毒理學研究的熱點之一，開展環境污染物的聯合毒性研究可為其健康風險評價和管理提供更加可靠的科學依據。

人類面臨同時暴露鄰苯二甲酸酯類化合物（PAEs）和有機磷阻燃劑（OPFRs）的風險，評價這兩類化合物的聯合毒性作用對人類健康的影響具有重要的意義。DBP和TPP是這兩類化合物中典型的污染物，目前有關兩者聯合毒性作用的研究鮮見報道。該研究以斑馬魚胚胎作為受試對象，探討DBP和TPP單獨和聯合暴露對發育的影響，結果表明DBP和TPP 單獨暴露引起斑馬魚畸形，導致斑馬魚孵化率和存活率下降、畸形率增加和體長縮短，這與前人的研究結果一致[18-20];DBP和TPP聯合暴露引起毒性表型與DBP和TPP 單獨暴露引起的毒性表型相同，DBP和 TPP聯合暴露也導致斑馬魚孵化率和存活率下降、畸形率增加和體長縮短。由此可見，DBP和TPP單獨及聯合暴露均影響斑馬魚胚胎發育。DBP和 TPP聯合暴露對斑馬魚仔魚存活率、畸形率和體長影響存在交互作用，對胚胎和仔魚孵化率的影響無交互作用。該研究結果對PAEs和OPFRs聯合暴露的健康風險評價具有重要意義，為這類物質風險管理提供有效的毒理學依據，對人類健康具有重要的現實意義。

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