急性腦血管病致多器官功能障礙綜合征心率變異性及乙酰膽堿、內毒素表達研究

崔瑤瑤 戴宏偉 賀燕 郭洪志

【摘要】目的：動態監測急性腦血管病（ACVD）致多器官功能障礙綜合征（MODS）患者乙酰膽堿（Ach）、內毒素表達及心率變異性（HRV）、急性生理及慢性健康狀況評分（APACHEⅡ），并與腔隙性腦梗死患者對比分析，探討ACVD致MODS時Ach、內毒素、交感-迷走神經功能的變化規律，及其與疾病嚴重程度的關系。方法：篩選ACVD致MODS患者（MODS組）、腔隙性腦梗死患者（腔梗組）各30例，分別于發病（入組）24h、72h、7d、14d空腹取血送檢，采用酶標記免疫吸附法檢測Ach的含量，改良基質顯色法鱟試驗測定內毒素含量;60例受試者各時相點評定HRV、APACHEⅡ，對比分析。結果：MODS組各時相點內毒素、APACHEⅡ評分、HRV的低/高頻段功率比（LF/HF） 均顯著高于腔梗組（P<0.01）;MODS組各時相點低頻段功率（LF）、高頻段功率（HF）均顯著低于腔梗組（P<0.01）;MODS組內毒素、LF/HF、與APACHEⅡ評分呈正相關。Ach與APACHEⅡ評分呈負相關。結論：ACVD致MODS患者均出現嚴重的內毒素血癥、交感-迷走神經張力失衡。內毒素血癥是導致疾病嚴重程度加重的主要因素，而迷走神經膽堿能系統在ACVD致MODS時發揮了潛在的保護作用。

【關鍵詞】急性腦血管病;多器官功能障礙綜合征;心率變異性;乙酰膽堿;內毒素

基金項目：山東省自然科學基金（NO.ZR2015HL120） 濟南市臨床醫學科技創新計劃（202019191））

Abstract：Objective By the continuous detection of acetylcholine（Ach）， endotoxin， heart rate variability （HRV） and the scores of acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ（ APACHE Ⅱ） in patients with multiple organ dysfunction syndrome （MODS） induced by acute cerebrovascular disease （ACVD） ， and the compare those indicators with patients of lacunar infarction people， make clear the changing rules of Ach， endotoxinand the Sympathetic-vagus nerve function and their relations with severity of diseases. Methods ?A total of 30 patients with ACVD-induced MODS （MODS group） and 30 patients with lacunar cerebral infarction （luminal infarction group） were screened. Take blood on empty stomach respectively in 24h， 72h， 7d and 14d. Detect the expression of Ach by adopting the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Determine the serum endotoxin by using improved substrate chromogenic limulus test. Make assessments and analyse comparatively the results of HRV， APACHE Ⅱ at every time point of the 60 subjects. Results ?Compared with lacunar infarction group at every time point， the levels of endotoxin，Ach ， APACHEⅡ and HRV named by low/high frequency power ratio （LF/HF）in MODS group were significantly higher（P<0.01）; The low frequency power （LF） and high frequency power （HF） in MODS group were significantly lower than those in lumen obstruction group （P < 0 01）. There was a positive correlation between endotoxin， LF/HF and APACHE Ⅱ score in MODS group. The levels of Ach were negatively correlated with APACHEⅡscore. Conclusion ?All patients with ACVD induced MODS developed severe endotoxemia and sympathetic - vagal tone imbalance.Endotoxemia is a major factor leading to disease severity and the vagal cholinergic system plays a potential protective role in ACVD induced MODS.

Keywords：Acute cerebrovascular disease; Multiple organ dysfunction syndrome; ?heart rate variability;endotoxin; acetylcholine

神經內分泌的改變在急性腦血管病（acute cerebrovascular disease，ACVD）導致多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的病程進展中起重要作用。ACVD發生時下丘腦等高級神經中樞可通過延髓內臟帶-迷走神經通路對周圍臟器功能進行調控，其中的膽堿能抗炎通路即由迷走神經及其主要遞質乙酰膽堿（acetylcholine， Ach）形成，而且該抗炎通路可能在MODS時對周圍臟器具有保護作用但具體機制尚未完全明了。本研究篩選ACVD致MODS患者、腔隙性腦梗死患者各30例，通過連續測定各時相的外周血內毒素、Ach的含量、心率變異性（HRV）及急性生理及慢性健康狀況評分（APACHEⅡ），研究上述指標在ACVD致MODS發生時的相關性，探索膽堿能抗炎通路在ACVD致MODS患者病程中的可能調控機制。

1、臨床資料

1.1. 分組：本研究受試者共60例，分為2組：MODS組、腔梗組各30例。

MODS組：篩選2015年7月-2018年2月山東中醫藥大學第二附屬醫院神經內科、神經外科收治的ACVD致MODS患者30例，其中男性18例，女性12例，平均年齡56.58±11.59歲;腦出血3例，腦梗死27例。

腔梗組：篩選2015年7月-2018年2月山東中醫藥大學第二附屬醫院神經內科收治的腔隙性腦梗死患者30例，其中男性17例，女性13例，平均年齡54.81±10.13歲。

以上2組患者的年齡、性別無顯著性差異（P均>0.05）。

1.2診斷標準：符合急性腦血管病診斷標準與中華醫學會全國腦血管病會議在1995年制定的腦梗死、腦出血、蛛網膜下腔出血的診斷標準;SIRS診斷標準與美國胸科醫師學院和心臟重癥醫學會協作會議在1991年提案的SIRS的臨床標準一致;MODS診斷及分期與廬山全國危重病急救醫學學術會議在1995年設定的《多臟器功能障礙綜合征（MODS）病情分期診斷及嚴重程度評分標準》相一致。

1.3入組標準：符合ACVD致MODS的診斷標準;發病在24h以內;入組者自愿參與本研究同時簽署知情同意書（無行為能力者由監護人同意并簽署）。

1.4排除標準：本次發病前即患有重大疾病如嚴重心、腦、肺、肝、腎、胃腸功能障礙、嚴重血液病、重癥感染等;3個月內參與過其他臨床試驗。

1.5剔除標準：出現嚴重不良事件而不能將本研究方案繼續者;受試者不配合本研究方案不能確信完成本研究者。

2、觀察指標及方法

MODS組和腔梗組受試者分別于發病24h、72h、7d、14d 4個時相點采集清晨空腹肘靜脈血15ml。10ml置于抗凝試管中2000r/min離心10min，分別吸取上層血清，置-80℃冰箱冷凍保存。采用改良基質顯色法鱟試驗測定內毒素含量，酶標記免疫吸附法（ELISA）檢測Ach的含量。60例受試者分別于發病/入組24h、72h、7d、14d4個時相點測定心率變異性（HRV），指標包括：低頻段功率（LF）、高頻段功率（HF）、低/高頻段功率比（LF/HF）、急性生理和慢性健康評分Ⅱ（The Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ，APACHEⅡ）。

3、統計學方法

試驗數據用均數±標準差 （X±S） 表示，應用SPSS17.0統計軟件包進行處理，組間差異顯著性檢驗采用方差分析及多重相關分析，組內比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有顯著意義。

4、結果

4.1 MODS組與腔梗組相比：MODS組內毒素含量、APACHEⅡ評分顯著高于腔梗組（P<0.01）;Ach表達72h顯著高于、24h和14d顯著低于腔梗組（P均<0.01）;HRV的LF和HF顯著低于、LF/HF 顯著高于腔梗組（P均<0.01）。（見表1-4）

4.2以各組APACHEⅡ評分為因變量（Y），以內毒素（X1）、LF/HF（X2）、Ach（X3）為自變量做偏相關分析顯示：Ach與APACHEⅡ評分測定值呈負相關，偏相關系數為-0.102;內毒素與APACHEⅡ評分測定值呈正相關;HRV評分與APACHEⅡ評分測定值偏相關系數為0.054，相關性低。各指標與APACHEⅡ評分相關及偏相關系數見表5.

5、討論

目前關于MODS的發病機制存在多種假說，其中腸道細菌易位、內毒素和炎癥失控假說已經被廣泛認可， 諸多證據顯示內毒素（endotoxin）即脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 是最重要的觸發因子。各種創傷應激時人體腸粘膜屏障破壞導致腸道細菌易位和內毒素血癥的發生，腸道內細菌、內毒素進入體循環后，通過表達上調的內毒素受體 CD14 系統激活多種炎癥細胞及活化體液徑路（如補體、凝血系統），刺激組織產生多種免疫反應，進而出現瀑布效應誘發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）;另一方面因腸黏膜通透性增加及細菌易位，使腸腔微生物及其產物經門靜脈入肝，刺激肝竇內皮細胞、Kuffer 細胞與肝細胞釋放多種炎癥介質，使炎癥反應不斷加重，誘發SIRS，導致 MODS 的發生。內毒素異常表達在該過程中處于核心地位，而且其可能對炎性因子具有增敏作用。脂多糖結合蛋白（lipolysaccharide binding protein ，LBP）的 N 末端與 LPS 的脂質 A 發生特異性的結合后， LPS 向 CD14轉遞炎性信號，而CD14通過體液免疫及激活炎性細胞啟動級聯反應，促使MODS進一步發展。有研究顯示，LPS 具有對內皮細胞等非髓樣細胞損傷的作用，并且其依賴于可溶性CD14（soluble CD14， sCD14）的參與，sCD14是內毒素的特異性受體蛋白，如果使用抗 CD14 抗體預處理，則可抑制血清依賴性的LPS對內皮細胞的激活作用，因此CD14 在介導 LPS 發揮生物學功能中發揮十分重要的作用。腦源性多器官功能障礙綜合征（CMODS）發生機制和臨床特點除MODS的特點外，還具有其特殊性。CMODS特別是重癥患者易觸發機體神經-內分泌-免疫網絡調控紊亂，導致過度炎癥反應，故ACVD致MODS具有發生快、病情進展迅速、病死率和致殘率高的特征。本團隊前期的系列實驗研究最先證實缺血性腦血管病導致的CMODS存在腸道內毒素易位和血清內毒素異常升高的現象;其后發現腦出血致MODS大鼠模型存在內毒素血癥和炎癥因子TNF-α、IL-1在各臟器的異常表達， 提示內毒素血癥刺激炎癥因子TNF-α、IL-1的異常釋放，誘發SIRS，導致MODS的發生;而且腦出血致MODS模型鼠除血清內毒素含量明顯升高外，內毒素受體CD14 mRNA和IL-1β在腸組織表達明顯增加，提示ACVD的嚴重打擊導致腸道粘膜屏障功能破壞，內毒素易位導致內毒素血癥，進而誘發炎癥因子釋放，導致失控的SIRS進而誘發MODS。本研究中MODS組患者各時相點內毒素含量和APACHEⅡ評分顯著高于腔梗組（P<0.01），進一步證實ACVD患者發生SIRS和各臟器損害過程中持續存在嚴重的內毒素血癥，LPS可能參與了ACVD致MODS的發生發展過程。

HRV是逐次竇性心搏之間心動周期的微小時間與頻率的變異，可以反映植物神經對心血管系統的影響。HRV 的頻域分析法以頻域范圍下面積作為定量觀察指標， 定量評價交感和迷走神經活性。低頻（LF）反映交感和副交感神經的雙重活性;高頻（HF）反映迷走神經活性，是心臟副交感神經支配的定量標志;LF/HF，反映交感神經活性。1996 年Godin 等提出了一種新的、互補的，有關MODS發病機制的假說，即相互關聯器官之間的“解偶聯假說”，其認為人體各相互作用器官之間的“解偶聯”促進了MODS 的發展，而這種解偶聯實際上是自主神經功能障礙的一種表現，并且可以通過HRV進行檢測。他們給健康志愿者靜脈注射內毒素，檢測到可逆的HRV的減低，說明在膿毒血癥時存在自主神經功能障礙，并且HRV減低是其重要特征表現。Seely 等應用非線性的分析方法來分析HRV，得出結論支持“解偶聯假說”，并強調HRV的改變是MODS的病理生理特點。王蕾等使用實驗性腦梗死模型，通過檢測HRV評價大鼠自主神經功能，結果發現腦梗死組HRV的相鄰RR間期差值的均方根、總功率譜和LF、HF較對照組降低，提示腦梗死引起心臟自主神經總活性降低、自主神經功能受損。心臟的交感和迷走神經傳出信號起始于大腦，分別走行于交感干和迷走神經，然后通過去甲腎上腺素、Ach與心臟各自受體結合。心臟起搏細胞上的受體偶聯觸發信號通道最終可引起起搏電流并通過“特種電流”（funny current，If）傳導。If 是由超極化環核苷酸門控通道（HCN）離子內流形成的電流。利用完整細胞插入鉗的方法對分離的人右心房肌細胞進行實驗，發現內毒素明顯地損害了If。此外，在內毒素作用的心肌細胞上，β腎上腺素對If的影響更加顯著。也就是說，內毒素在抑制竇房結功能的同時，β腎上腺素對竇房結的影響更加顯著。這說明了為何HRV在MODS中降低，因為降低的HRV是患者自主神經功能障礙的一個重要特征，并且是預后不良、病死率增加的標志。本研究中MODS組患者各時相點LF、HF均顯著低于腔梗組（P均<0.01），LF/HF均顯著高于腔梗組（P均<0.01），提示ACVD致MODS患者，交感和副交感神經活動均減弱， 但交感神經活動仍占優勢，即迷走神經活性處于相對較低的狀態，存在交感-迷走神經張力失衡。

迷走神經分泌的Ach不僅是神經傳導的主要遞質， 在神經信號傳導的過程中起了關鍵的作用，而且在神經內分泌免疫調節網絡也發揮重要的作用，它和β腎上腺素共同調控交感神經和副交感神經的興奮性，決定人體自主神經的功能狀態。Ach通過迷走神經下調炎性因子TNF-α等的表達，繼而SIRS得到控制乃至各種原因所導致的MODS的結局也得以改寫。本團隊前期實驗研究也證實迷走神經可將炎癥信息在中樞和外周相互傳遞，SIRS的降低也可通過增強迷走神經傳出來實現，提示迷走神經膽堿能抗炎通路的興奮對周圍臟器具有保護作用，其機制與抑制SIRS有關。本研究中MODS組患者Ach表達72h較腔梗組高 （P<0.01）、24h和14d則顯著低于腔梗組（P<0.01），說明在ACVD致MODS過程中副交感神經作用仍以抑制狀態為主。本研究還顯示以APACHEⅡ評分為因變量的相關分析結果中，內毒素、LF/HF與APACHEⅡ評分均呈高度正相關，Ach與APACHEⅡ評分相關性低。偏相關分析顯示：內毒素對APACHEⅡ評分影響強度高，LF/HF對APACHEⅡ評分影響強度低，Ach與APACHEⅡ評分為負相關，但影響強度低，說明神經功能受損及內毒素血癥對患者疾病嚴重程度影響最為直接，符合內毒素作為MODS過程中的始動因子的作用機制。而Ach受體可能受到內毒素抑制，β腎上腺素對心臟腎上腺素能受體的作用則更加顯著，呈現副交感神經被抑制的表現，故而在MODS過程中的Ach發揮的影響較內毒素低，而HRV也因受交感神經及副交感神經功能失調的影響，在MODS過程中對疾病嚴重程度的影響也較低。

綜上所述，本研究證實ACVD致MODS患者均出現嚴重的內毒素血癥、交感-迷走神經張力失衡。內毒素血癥是導致疾病嚴重程度加重的主要因素，而迷走神經及其遞質Ach則表現出潛在的保護作用，進一步探尋安全有效地增強迷走神經興奮性以增加Ach遞質釋放的方法可能成為ACVD致MODS臨床治療的新靶點。

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通訊作者：賀燕