豬腹瀉相關的冠狀病毒檢測方法研究進展

向 萌，陳弟詩，任玉鵬，王一丹

（1.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；2.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

豬腹瀉病是危害養豬業主要的傳染病之一，其中以病毒性腹瀉的發生率最高、危害最嚴重[1]。冠狀病毒是引起仔豬腹瀉的重要病原，主要包括豬流行性腹瀉病毒 （Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒 （Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）、豬德爾塔冠狀病毒 （Porcine delta corona virus, PDCoV）和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV）[2]。4種病原感染豬均以嘔吐、腹瀉、脫水和腸道出血為主要特征，且常常呈現隱性感染或多病原混合感染，給相關疫病的診斷帶來了困難。PEDV和TGEV是目前分布最廣的豬腹瀉病毒性病原，對哺乳仔豬致死率可達100%[3]，近5年來在我國四川、福建、吉林、陜西、甘肅、黑龍江、江蘇、山東、遼寧、廣西和河北等多個省份均有流行[4-6]。PDCoV自2012年首次發現于中國香港后迅速蔓延至世界各地，在我國豬群中檢出率日益增長，成為危害我國養豬業的重要病原[7]。如2017—2018年，在河南地區豬腹瀉樣本中，PDCoV陽性率達35.06%，與PEDV混合感染率達24.03%[8]。此外，SADS-CoV也是近年出現的引起豬群消化道癥狀的一種新型豬冠狀病毒，在2016年于我國廣東首次發現。據統計，僅2017年由這種病毒引起的國內豬只死亡數達25 000頭，造成了較大的經濟損失[9-10]。

PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV均能引起仔豬腹瀉，具有相似的臨床癥狀和病理特征，還呈現出舊病新發、新病頻發的流行特點，給疾病的快速鑒別檢測帶來了巨大困難。此外，當前國內基層獸醫對仔豬病毒性腹瀉診斷時，往往優先考慮為PEDV和TGEV感染，而忽視對PDCoV和SADS-CoV等新發病原的檢測。因此，本文對前述4種引起豬腹瀉的冠狀病毒檢測方法相關研究資料進行總結，以期為豬病毒性腹瀉的快速診斷、精準防控提供理論指導和技術參考。

1 病原分離培養法

病毒分離培養法是病毒性疾病傳統又重要的檢測手段，其優點在于檢測結果準確性和可靠性高，同時也為后續深入研究病原特性提供了重要材料。目前常用豬腎細胞（PK-15，IBRS2）和豬睪丸細胞（ST）培養TGEV。如陳煥春等[11]將陽性TGEV腸系膜淋巴結處理后在IBRS2細胞系中盲傳9代后出現明顯的細胞病變。自1988年Hofmann等[12]用非洲綠猴腎細胞（Vero）成功分離PEDV，并且檢測可穩定傳代后，這種方法便一直沿用至今。但當前國內外對PDCoV和SADS-CoV的分離培養體系尚未完全確定。有證據表明，PDCoV陽性樣品處理后，能在豬的近端腎小管細胞系（LLC-PK）中穩定有效地增殖，并在連續傳代15次后，出現明顯的細胞病變[13]。雖然病毒分離培養法具有重要意義，但由于過程相對耗時，且不同毒株對宿主細胞的易感性和培養條件存在差異，因此該方法不適用于臨床上對病原的快速檢測。

2 血清學檢測法

2.1 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是最常用的血清學診斷技術之一，對疾病的初步診斷和抗體監測具有重要意義，主要包括間接ELISA、雙抗夾心ELISA和抗體捕獲ELISA等，而冠狀病毒高度保守的囊膜蛋白（Membrane, M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein,N）為冠狀病毒重要的結構蛋白，均能誘導機體產生細胞免疫，常被作為包被抗原。同時M、N蛋白氨基酸序列高度保守，不同冠狀病毒N蛋白氨基酸序列同源性在15%～30%之間，以此建立的ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性及穩定性。如楊朋霞等[14]以PEDV純化重組的N蛋白作為包被抗原建立了PEDV的間接ELISA方法，用該方法與商品化試劑盒檢測結果符合率達99.6%，此方法能在一定程度上反映豬群的抗體水平，但并不能真實反映豬體的免疫保護力，只有中和抗體才是真實反映豬只機體的抗病力指標。因纖突蛋白（Spike protein, S） 在各冠狀病毒種內或種間具有較高的遺傳變異性，也是介導病毒粒子進入細胞和誘導機體產生中和抗體的關鍵。因此選用該蛋白保守區作包被抗原，可有效鑒別不同毒株引起的感染。例如：Thachol等[15]建立了以PDCoV S1蛋白保守區域作為抗原的間接ELISA方法并應用于PDCoV抗體檢測，該方法不易與其他冠狀病毒發生交叉反應，具有良好的特異性；此外，陳靜等[16]以純化的重組PEDV中國變異株S蛋白為包被抗原，建立了檢測PEDV流行株抗體的間接ELISA方法，該方法具有較高的特異性，與RT-PCR檢測結果符合率達100%，可能成為監測PEDV流行情況的有效方法。

2.2 免疫層析技術

近年來免疫層析技術由于其特異、簡便、快速的特點在獸醫臨床上被廣泛應用，具有巨大的發展潛力和應用前景。免疫層析技術是基于抗原抗體特異性反應的一種新型膜檢測技術，通過肉眼可見的標記物使檢測結果直接可觀。目前常見的免疫層析技術主要包括膠體金免疫層析技術、熒光免疫層析技術以及磁珠免疫層析技術等，其中PEDV和TGEV膠體金免疫層析技術在豬冠狀病毒的診斷中最為常見。如賈宇旻等[17]根據PEDV免疫BALB/c 小鼠后分泌的MAb中的 4H為檢測抗體、5A9 為捕獲抗體初步建立了檢測 PEDV 的膠體金免疫層析技術，該方法最低檢測限為 7.8×103TCID50/mL，與RT-PCR法符合率達93%，為獸醫基層對PEDV的快速診斷提供了新的技術手段。但目前關于豬腹瀉相關的幾種新型冠狀病毒的免疫層析技術研究相對匱乏，仍需科研工作者不斷突破。

2.3 免疫熒光技術

免疫熒光技術是將免疫學方法與熒光標記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法，通過熒光素標記抗原或抗體的方法對組織、細胞內的抗原或抗體進行檢測，從而實現對抗原定性、定位和定量的分析，該方法對病原的血清學檢測以及病原在組織細胞內的動態分布研究具有重要意義，但也存在方法耗時長、對實驗室及操作人員技術要求高等缺陷，而不適用于臨床樣本檢測。馬思奇等[18]早在1982年就用免疫熒光法檢查扁桃體應用于活體診斷TGE，既適用于早期感染，也適用于慢性或隱性帶毒豬的診斷，對豬腹瀉病的早期診斷具有重要的意義。近年來免疫熒光技術在豬腹瀉相關冠狀病毒檢測中也在不斷發展，但目前主要見于PEDV和TGEV免疫熒光技術研究的報道。如朱蘊暖等[19]利用TGEV N蛋白的單克隆抗體為一抗，熒光素FITC標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，建立了TGEV的間接免疫熒光檢測方法，該方法具有良好的特異性，為TGEV病原學檢測提供技術支撐，為TGEV感染細胞后的定位和動態分布提供了有效的檢測手段，也為豬腹瀉相關冠狀病毒感染機制的研究打下前期基礎。

3 分子生物學檢測方法

3.1 反轉錄聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應 （Polymerase Chain Reaction,PCR）是目前檢測豬腹瀉相關冠狀病毒最常用的手段，其最大的特點是能將微量的DNA大幅擴增，可用于檢測疑似感染豬的糞便、直腸拭子或腸道樣品中的基因組。通過保守基因M、N建立的豬冠狀病毒RT-PCR檢測方法，特異性好、準確性高，可為疾病診斷提供更準確、更科學的信息，但此方法在臨床上無法區分野毒株和疫苗株以及不同型毒株，因此針對S基因以及ORF3基因建立的RTPCR檢測方法對病原的分型以及深入的分子機制研究具有重要意義。如闞蕊慈等[20]根據PEDV野毒株和疫苗株ORF3基因的差異設計特異性引物，建立了可區分PEDV野毒株和疫苗株的多重RT-PCR方法，為PEDV的快速精準檢測提供了有效的工具。此外，由于豬腹瀉相關的冠狀病毒在感染豬群后具有相似的臨床癥狀，眾多學者致力于對病原快速鑒別診斷的研究，多重RT-PCR技術應運而生，得到廣大學者的支持。如韋學雷等[21]根據PDCoV N基因、PEDV M基因和TGEV N基因序列，建立了能同時檢測3種豬冠狀病毒的多重RT-PCR方法，有良好的臨床應用價值。黃海鑫等[22]根據PDCoV和SeACoV N基因建立的雙重RT-PCR方法，最低檢測量為4.73×101copies/μL，為兩種豬新型冠狀病毒快速檢測提供了新的技術手段。

3.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術融合了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量等優點，通過檢測熒光信號強度直接對產物進行定性分析和定量分析。目前關于PEDV、TGEV和PDCoV的熒光定量PCR檢測技術已趨向成熟，國內外眾多學者建立了多種針對單一或多個病原的熒光定量PCR檢測方法，如王以欣等[23]建立的基于雙啟動寡核苷酸引物檢測PEDV的熒光定量PCR方法對質粒標準品最低檢測限為1.64×101copies/μL，組內、組間重復性結果的變異數均小于1%，可為PEDV準確、快速的臨床檢測提供技術支持。此外，施開創等[24]針對PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和豬輪狀病毒VP6基因建立的4重TapMan熒光定量RT-PCR檢測方法對相關病毒的快速診斷更是具有重要意義，但目前關于SADS-CoV的熒光定量PCR檢測方法的研究相對較少，亟待補充。

3.3 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一種新的DNA擴增方法。該技術依賴于自動循環的鏈置換反應，利用4對特異性的引物在等溫條件下1 h內即能擴增出 1×109copies的靶序列，該方法無需昂貴的試驗設備及試劑，操作簡單，結果直觀，是當前病原檢測方法研究熱點之一。目前已有LAMP檢測技術應用于豬冠狀病毒的檢測，但在獸醫臨床上并未廣泛應用。如焦韻潔等[25]建立的TGEV可視化RT-LAMP檢測方法在恒溫水浴鍋中1 h即可完成檢測，比普通PCR方法高2個數量級，并以羥基萘酚藍為指示劑，使結果直接可觀。Zhang等[26]建立的PDCoV RT-LAMP 的檢測方法，敏感性比普通PCR高出100倍左右，與巢式PCR符合率為100%?？梢奓AMP方法為豬群冠狀病毒的基層診斷及病原流行病學調查提供了更為有效的手段。

4 新型檢測方法在豬冠狀病毒檢測中的應用

隨著分子生物學技術及其交叉學科的不斷發展，近年來多種簡便快捷的新型病原分子檢測方法不斷涌現，如：恒溫熱隔絕式PCR （Insulated isothermal PCR, iiPCR）、重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase Amplification, RPA）和微滴式數字PCR（Droplet digital PCR, ddPCR）。iiPCR是一種基于Rayleigh-Benard對流原理的新型擴增技術[27]。利用儀器底部單一熱源加熱，使毛細管內部液體自然對流形成PCR各步驟反應所需溫度而實現PCR擴增，針對此方法研發的小型核酸分析儀器，反應時間僅需42 min，檢測結果直接顯示于屏幕，與傳統熒光定量PCR方法相比，縮短了反應時間，操作更加簡便，更是達到了檢測儀器的小型化而適用室外快速檢測。該技術于2002年首次報道以來[28]，已有多種病原的iiPCR技術相繼問世，但iiPCR在豬冠狀病毒的檢測僅見于PEDV和PDCoV。如沈思思等[29]采用PEDV S基因設計引物和探針，建立了用于檢測PEDV的iiPCR，其靈敏度高于普通熒光定量PCR方法，具有良好的應用價值。目前關于iiPCR檢測技術的報道僅見于單病原的檢測，因此在臨床檢測時需考慮多個病原，防止漏檢。RPA被稱為可以替代PCR的核酸擴增技術，該技術依賴于重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶3種重要組分，無需特殊控溫儀器，在25～42 ℃條件下就能實現對DNA或者RNA的擴增，也可結合凝膠電泳、測流層析試紙條、熒光探針和生物芯片等多種技術檢測結果，真正意義上實現了病原檢測的快速便捷，但RPA技術正處于不斷發展過程中，其引物及探針設計尚不成熟，還需要研究者進行摸索優化。目前RPA在豬冠狀病毒檢測中的應用不為常見，但肖帥等[30]建立的PDCoV的RPA方法具有高特異性及靈敏性，為豬腹瀉相關冠狀病毒新型RPA檢測方法的建立奠定了基礎。ddPCR為第3代PCR技術[31]，該技術通過將樣品無限稀釋至納米級微滴，使每個微滴形成獨立的反應體系，通過終點信號計算靶分子的拷貝數，該方法是在熒光定量PCR基礎上發展而來，不依賴于標準曲線和Ct值，實現了病原的絕對定量[32]。該技術不僅能對單一病原進行定量的分析，亦可對兩種病原同時檢測。但目前尚未有同時檢測3種及以上病原的ddPCR檢測方法的報道。目前已有PEDV和TGEV雙重微滴數字PCR商品化試劑盒投入市場，并取得了良好的臨床效果。上述新型分子生物學診斷技術為疫病病原更加快速、精準、高效檢測提供了可能。

5 小結與展望

豬腹瀉相關冠狀病毒給世界各地的養豬業均造成了巨大威脅，而快速精準的診斷是疫病防控的關鍵之一。目前關于豬冠狀病毒檢測方法的研究多集中于血清學和分子生物學檢測方法。其中ELISA、免疫層析等血清學檢測方法成本低、操作簡單快速，可滿足大批量樣本檢測，在基層獸醫臨床診斷和血清抗體監測中得到廣泛應用，但也存在特異性、敏感性相對較低的缺點。而傳統分子生物學檢測方法如PCR、多重PCR、熒光定量PCR等技術在特異性和靈敏性上有了大幅度的提高，實現了對病原定性到定量的分析，單一病原到多重病原的鑒別檢測，提升了檢測效率及準確率，可快速鑒別多種腸道病原以及快速區分不同基因型，但仍需要較高的試驗條件和成本而不適用于大規模的臨床樣本和基層獸醫診斷。近年出現的ddPCR、iiPCR和RPA技術等新型分子檢測技術正在克服血清學技術和傳統PCR技術的弊端，為病原更加快速、便捷和高效地檢測提供了可能，也是豬冠狀病毒檢測方法研究的新方向。