雙管離子選擇性微電極制備方法研究

李進海，薛 琳，周 橋，黃 嵐，王忠義

雙管離子選擇性微電極制備方法研究

李進海1，薛 琳2，周 橋1，黃 嵐1，王忠義1※

（1. 中國農業大學信息與電氣工程學院，北京 100083；2. 北京聯合大學智慧城市學院，北京 100101）

雙管離子選擇性微電極被廣泛應用于植物細胞外離子流速和細胞內離子活度的測量，但雙管離子選擇性微電極（Ion-Selective Microelectrode，ISME）的制備過程繁瑣，不可控因素多，制備成功率低。針對存在的問題，該研究提出了一種簡易、快速的雙管ISME制備方法。首先，介紹了雙管微電極制備、硅烷化和電極尖端灌充液態離子交換劑（Liquid Ion Exchanger，LIX）的具體流程；其次，對制備的雙管ISME的能斯特斜率和響應時間進行了測試。試驗結果表明，使用蒸汽硅烷法對雙管微電極進行硅烷化處理，最優硅烷化溫度、二甲基二氯硅烷劑量和硅烷化時間分別為150 ℃、45L和90 min；制備的雙管氫離子、鉀離子、鈣離子、氯離子選擇性微電極的能斯特斜率分別為54.08、56.51、27.08和-58.80 mV/dec；4種雙管ISME的響應時間介于0.20～0.42 s之間。研究結果表明，由該研究制備方法制作的雙管ISME，可以滿足植物細胞外離子流速和細胞內離子活度信息檢測的要求。雙管ISME的快速制備，降低了離子選擇性微電極技術的應用難度，將有利于植物電生理檢測試驗的進行和離子選擇性微電極技術在農作物育種、生理抗逆、植物營養吸收與同化等研究領域的應用。

微電極；試驗；雙管離子選擇性微電極；硅烷化；制備方法

0 引 言

離子選擇性電極（Ion-Selective Electrode，ISE）是一種電化學傳感器，可將溶液中特定離子的活度轉換為電位，因此也稱為特定離子電極（Specific Ion Electrode，SIE）。由于離子選擇性電極功能的實現需要借助對特定離子具有選擇性響應的電極膜，因此又稱為膜電極。根據國際純化學和應用化學聯合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）建議，離子選擇膜分為液態膜、固態膜和特殊膜等[1]。液態膜又稱液態離子交換劑，具有良好的線性檢測范圍和快速的動態響應時間，可作為離子選擇性膜灌充在玻璃微電極的尖端，制成離子選擇性微電極。離子選擇性微電極技術實現了在介觀時空尺度對植物的電生理活動的監測，包括對植物細胞外離子流速的動態檢測和對細胞內特定離子活度的實時測量[2-3]。

細胞外離子流速動態檢測是指在不損傷生物活體樣品的前提下動態監測離子進出細胞膜的過程[4-5]。1974年，美國海洋生物學實驗室（Marine Biological Laboratory，MBL）的神經科學家Jaffe等[6]首次提出了無損檢測的原始概念，并采用振動電極技術實現了對細胞外電流信號的測量。1990年，Kühtreiber等[7]在已有的細胞外電流檢測系統的基礎上，利用微電極振動技術和離子選擇性電極首次記錄到了細胞外的鈣離子流速，開創了離子跨膜研究由靜態轉為動態的先河。細胞外離子流速檢測可以在不破壞細胞的情況下檢測離子進入細胞的流速和方向，為判斷植物的生理狀態提供依據[8-9]。目前應用該技術可以測量的離子包括鈣離子（Ca2+）、氫離子（H+）、鉀離子（K+）、鈉離子（Na+）、氯離子（Cl-）、鎂離子（Mg2+）、鎘離子（Cd2+）、銨根離子（NH4+）和硝酸根離子（NO3-）等[10-12]。細胞內離子活度的測量，實際上是將膜電位測量技術與離子選擇性微電極技術相結合，在活體條件下直接將離子選擇性微電極刺入單個細胞，測定細胞內特定離子活度的實時變化。該技術被廣泛用于分析離子在細胞中的區域化分布和研究植物對養分離子的吸收機制[13-15]。ISME的成功制備是實現離子選擇性測量的先決條件。ISME分為單管和雙管ISME，通常使用硼硅酸鹽玻璃毛細管拉制而成，其內部灌充電解質溶液和液態離子交換劑。單管ISME制備工藝成熟，制作過程比較簡單，但無法消除電遷移或膜電位變化對數據獲取產生的干擾，影響測量數據的準確性。雙管ISME可以很好地解決試驗中的干擾問題，能夠獲取更為準確的生理信息數據，但制作過程繁瑣、不可控因素多，制備成功率低[16-18]。

綜上，為了獲取更為準確的離子活度和離子流速信息，針對雙管ISME制備存在的問題，本研究利用單根隔壁式（一管雙腔）硼硅酸鹽玻璃毛細管制作雙管微電極，提出一種簡易、高效的雙管微電極灌充方法，并確定了雙管ISME的硅烷化參數，對制備的雙管鉀離子、鈣離子、氫離子、氯離子選擇性微電極的能斯特斜率和響應時間進行測試。雙管ISME的快速制備，將有利于促進離子選擇性微電極技術在農作物育種、生理抗逆和植物營養吸收與同化等研究領域的應用。

1 雙管離子選擇性微電極（ISME）工作原理

1.1 雙管離子選擇性微電極（ISME）測定植物細胞外離子流速

但當植物細胞產生動作電位時，細胞（或者組織）作為一個點源會影響細胞外空間中的電場分布[22-23]，此時電遷移對離子流速測量的影響不可忽略。此時伴隨電極需同步測得兩測量點1和2處的電壓值21和22。基于能斯特-普朗克（Nernst-Planck）方程，得到準確的離子流速如式（2）所示。

式中F為法拉第常數，F=96 485.33 C/mol；為基液中待測離子的濃度，mol/L。為絕對溫度，K；R為理想氣體常數，R=8.314 J/(K·mol)；為離子的化合價；Δ為伴隨電極在1和2間的電勢差，V。

1.2 雙管離子選擇性微電極（ISME）測定植物細胞內離子活度

植物細胞膜電位的測量通常是將尖端直徑小于1m的單管玻璃微電極內部灌充電解質溶液，然后刺入細胞，通過氯化銀電極、前置放大器與數據采集系統相連，經模數轉換后得到膜電位的變化數值[20]。微電極刺入植物細胞后，測得的電極與基液中參比電極間的電勢差即為細胞的膜電位。若將硅烷化后的單管微電極尖端灌充LIX后再刺入植物細胞，則可對細胞內特定離子的離子活度進行選擇性測量（圖1）。在進行植物細胞內離子活度測量時，測得的數據是ISME與基液中參比電極間的電勢差3（mV），這個電勢差不僅包含ISME刺入細胞后，ISME響應離子活度的能斯特電勢i（mV），還包含該細胞的膜電位4（mV）。因此，欲得到準確的離子活度值，需要先扣除膜電位的影響，即i=3-4，再將i經過該電極的能斯特方程計算后，可得到相應離子在細胞內的離子活度。

1.液態離子交換劑 2.離子選擇性微電極的內充電解液 3.伴隨電極的內充電解液

1.Liquid ion exchanger 2.Filling electrolyte solution of the ISME 3.Filling electrolyte solution of the accompanying electrode

注：1和2為雙管ISME測定細胞外離子流速時的2個測量點；11和12分別為離子選擇性微電極在2個測量點測得的電壓值，mV；21和22為伴隨電極在2個測量點測得的電壓值，mV；3和4分別為利用雙管ISME測定細胞內離子活度時離子選擇性微電極和伴隨電極測得的電壓值，mV。

Note:1and2are the two measuring points for the double-barreled ISME to measure the extracellular ion flux;11and12are the voltage values measured by the ISME at1and2, respectively, mV;21and22were the voltage values measured by the accompanying electrode at the two measuring points, mV;3and4are the voltage values measured by the ISME and the accompanying electrode respectively when the intracellular ion activity was measured by double-barreled ISME, mV.

圖1 雙管離子選擇性微電極工作原理示意圖

Fig.1 Schematic diagram of working principle of double-barreled Ion-Selective Microelectrode (ISME)

2 雙管離子選擇性微電極（ISME）的制備

2.1 雙管微電極的制備

雙管ISME的制備分為3步，分別為制作雙管微電極，雙管微電極硅烷化以及在雙管微電極尖端灌充LIX，因此制備雙管ISME首先要制作雙管微電極。傳統雙管微電極的制備方法極為復雜，制作流程如圖2a所示。1）將2支硼硅酸鹽玻璃毛細管固定。2）將2支固定在一起的玻璃毛細管穿過加熱絲，加熱后將玻璃毛細管扭轉180°。3）使用拉制儀（P97，Sutter，美國）將扭轉后的玻璃毛細管拉制成尖端直徑符合要求的微電極。4）利用酒精燈將雙管微電極中的伴隨電極尾端燒彎，便于將LIX與電解液從電極尾部灌入后使用壓力推至電極尖端。傳統雙管微電極制備采用上述工藝的主要原因是傳統雙管ISME制備無法采用簡單地正向灌充LIX的方法而只能選擇背向灌充LIX。本研究在解決了雙管ISME正向灌充LIX工藝的基礎上（詳見2.3）利用隔壁式硼硅酸鹽玻璃毛細管?Septum Theta（TST150-6；World Precision Instruments，美國）制作雙管微電極（圖2b），該方法無需復雜的制備工藝，只需使用拉制儀將隔壁式硼硅酸鹽玻璃毛細管拉制成尖端直徑為6～10m的雙管微電極。

2.2 雙管微電極的硅烷化

硼硅酸鹽玻璃表面存在大量游離的OH-基團，具有親水疏脂的特性，導致具有脂類特性的LIX無法在電極的尖端長時間保持[24]。硅烷化的目的是使微電極的管壁呈現親脂性，進而提高電極的使用壽命。雙管微電極中伴隨電極的內充液是電解質溶液，硅烷化后易在電極尖端形成空腔，因此硅烷化時，使用耐高溫的導熱硅脂將伴隨電極末端封住，也可以使用醫用凡士林。本研究使用蒸汽硅烷法對雙管微電極進行硅烷化處理（圖3），硅烷化試劑為二甲基二氯硅烷。硅烷化器皿為100 mL的玻璃燒杯，使用硅膠薄膜將燒杯口罩住，硅膠薄膜上有孔洞用于固定電極。硅烷化時，將電極尖端朝上放置，非尖端插入孔洞，薄膜的彈性會將電極緊密束縛，隨后整體放入恒溫箱中加熱。本研究關于電極硅烷化的試驗，是在以往關于單管離子選擇性微電極硅烷化研究基礎上進行的[24]，其目的是為了進一步探索雙管離子選擇性微電極尖端保持LIX能力最強時的硅烷化條件。

2.3 雙管微電極的灌充

灌充LIX在雙管ISME的制備過程中最為困難。傳統雙管ISME制備時采用2支單管玻璃毛細管合并而不使用1支雙管玻璃毛細管，目的是為了將玻璃毛細管的末端彎曲，以便于灌充。微電極的灌充分為正向灌充和背向灌充。正向灌充時，先在微電極的內部灌注電解質溶液，然后將電極尖端接觸LIX池，隨后LIX會被吸入到微電極的尖端。正向灌充時使用的LIX量較少，可使用商品化的離子載體混合物（如表1所示）。由于背向灌充成功率低，為了降低成本一般自行配制LIX：將一定比例的離子載體、增塑劑、添加劑和基質溶解于四氫呋喃，混合均勻后用微量進樣器將LIX從離子選擇性微電極的尾部注入，隨后在干燥瓶中放置3 d，待四氫呋喃完全揮發后，電極尖端會留下固態或半固態的離子選擇性膜，最后向微電極內灌注電解質溶液。

表1 商用液態離子交換劑及其對應的內充電解液

正向灌充方法簡單，電極制作成功率高。背向灌充的過程較為繁瑣，存在一些不可控的因素，電極制作成功率低，例如電極尖端離子選擇性膜的成型容易出現問題、無法與管壁有效貼合、或者膜上存在孔隙等；同時，背向灌注電解液時，電解液與液態膜可能無法形成有效的接觸液面；亦或在電極中存在無法排出的氣泡甚至氣柱等。正向灌充在單管ISME制備中得到廣泛的應用，而在雙管ISME制備中卻不適用。主要原因是雙管ISME的伴隨電極在灌充時會同步吸入LIX（硅烷化的目的只是提高LIX在玻璃微電極尖端的保持能力）。即使利用壓力將LIX從伴隨電極中推出，LIX也會從離子選擇性電極再次被吸入到伴隨電極尖端，這也是自行配制的離子選擇性膜需要呈現半固態（流動性較弱）的原因。

雙管ISME尖端灌充LIX的具體過程如下：

1）配制瓊脂溶液。使用與伴隨電極電解液成分相同的無機鹽溶液配制濃度為0.3%～0.5% 瓊脂溶液，并用磁力攪拌器將瓊脂溶液攪拌加熱至沸騰；

2）使用微量進樣器將10L沸騰的瓊脂溶液注入伴隨電極，隨后使用壓力注入法將溶液推至電極尖端；

3）在瓊脂溶液凝固前，使用微量進樣器向伴隨電極中灌注20L電解質溶液，其成分與基液成分相同。由于瓊脂溶液中無機鹽離子濃度與伴隨電極內充液中無機鹽離子濃度相同，因此不會對后續的測量產生影響；

4）使用微量進樣器向離子選擇性微電極內灌充30L電解液（表1），并使用壓力注入的方法將電解液推至電極尖端；

5）使用正向灌注的方法灌充LIX。將雙管ISME接觸LIX池，LIX會被吸入離子選擇性微電極，伴隨電極由于瓊脂塊的阻擋，不會吸入LIX。

需要注意的是，瓊脂溶液的凝固時間隨著瓊脂濃度的增加而縮短，濃度過高，瓊脂溶液會在伴隨電極尖端快速凝固；反之，若濃度過低則容易產生氣泡。伴隨電極的內充液為100 mmol/L氯化鉀溶液，測量離子流速時的伴隨電極內充液為基液，一般為2 mmol/L 氯化鉀和1 mmol/L氯化鈣的混合溶液。使用改進灌充方法制備的雙管ISME如圖4所示。

3 雙管離子選擇性微電極（ISME）性能測試

雙管ISME的性能測試在中國農業大學開發的自參考離子選擇性微電極技術（Self-referencing Ion Electrode Technique，SIET）測試系統[20]上進行。該系統采用離子選擇性玻璃微電極和膜電位玻璃微電極作為傳感器，將傳感器通過高輸入阻抗前置放大器連接到動態測量系統，實現對植物細胞外離子流速、細胞內離子活度以及細胞膜電位的測量。

3.1 硅烷化效果測試

電極硅烷化的效果直接決定了ISME的使用壽命。薛琳[24]通過大量試驗驗證了時間（min）、溫度（℃）、試劑用量（L）等因素對單管ISME硅烷化效果的影響。發現當硅烷化器皿為100 mL，二甲基二氯硅烷劑量、硅烷化時間和溫度分別為20L、30～45 min、150 ℃時，硅烷化的效果最佳，并確定影響硅烷化效果的敏感性因素由大到小依次為硅烷化溫度、硅烷化試劑用量和硅烷化時間[20]。本研究對改進的雙管ISME進行硅烷化時，發現在20L、30～45 min、150 ℃的組合參數下，硅烷化效果并不穩定，因此通過設計電極的硅烷化梯度試驗，對雙管ISME的硅烷化參數進行調整，以找到普適性最強的雙管ISME硅烷化組合參數。

3.2 能斯特斜率測試

能斯特斜率是檢驗離子選擇性微電極制作成功與否的標準。利用離子選擇性電極檢測植物細胞外離子流速和細胞內離子活度前，需要對電極的能斯特斜率進行標定。ISME的實測能斯特斜率可由電極浸入溶液時的電位（，mV）與標定液中待測離子的離子活度之間的關系得到，如式 （3）所示。然后與式（4）得到的理論能斯特斜率值進行比較。離子選擇性微電極的實測能斯特斜率應不小于理論能斯特斜率的90%，否則電極被認為不符合工作要求[25]。

式中0為能斯特截距，mV；為能斯特斜率，mV/dec。測試得到的能斯特斜率與理論值越接近，說明電極性能越好。

3.3 響應時間測試

測量植物細胞外離子流速時，需要將ISME以固定時間在1與2間2個固定點間（圖1）做往復運動。ISME分別在2個固定點處短暫停留，分別測出ISME在1、2處的響應電位值。電極在2個測量點停留的時間可由系統設置，但必須不小于選擇性膜的響應時間。響應時間是指從離子選擇性微電極接觸標定液時起到電極電位穩定值的95%所經過的時間[25]，本研究測試了K+、Ca2+、H+、Cl-共4種雙管ISME的響應時間，測試現場如圖5所示。

4 結果與分析

4.1 最優硅烷化參數

由于硅烷化對溫度最為敏感，使得硅烷化的效果不容易被控制，因此本研究在課題組先前研究獲取的單管微電極硅烷化參數的基礎進行進一步研究[24]，在保持溫度（150 ℃）不變的條件下，通過調整硅烷化試劑用量和硅烷化時間來獲取最優參數組合。使用的硅烷化器皿容積為100 mL，一次性硅烷化6根電極，硅烷化試劑為二甲基二氯硅烷。由于燒杯材料為高硼硅酸鹽玻璃，因此在首次硅烷化時對燒杯進行硅烷化處理。處理時使用硅膠薄膜將燒杯罩住，向燒杯內注入200L二甲基二氯硅烷，在150 ℃溫度下烘烤2 h，使燒杯壁完全硅烷化。試驗時，將尖端灌充100m LIX的雙管ISME在溶液中以0.5 Hz的頻率往復移動30 min，顯微鏡下觀察尖端LIX的剩余量，剩余量越多，保持液態離子交換劑的能力越好。雙管ISME硅烷化梯度試驗設計如表2所示。

不同種類ISME所需的硅烷化條件不同，相對而言，Ca2+選擇性電極對電極硅烷化的條件要求并不苛刻，而Cl-選擇性電極隨著應用硅烷化試劑量和時間的增加，測試時尖端仍會有少量的LIX滲出，雖然會在一定程度上影響尖端電位的穩定，但短時間測量不會產生較大影響。由表2試驗數據可知，使用45L試劑（二甲基二氯硅烷）在150 ℃下烘烤90 min得到的離子選擇性電極保持液態離子交換劑能力的普適性最強。

注：每組試驗的樣本數為6，液態離子交換劑剩余量為每組樣本的平均值±標準差；“—”是由于該試驗條件下，部分電極尖端的LIX出現分段現象，這是由于“過硅烷化”導致的，此時電極不可用。

Note: The number of samples in each group was 6. The remaining amount of the liquid ion exchanger was means ± standard deviation of each set of samples. “—” means the segmentation phenomenon of LIX at some electrode tips under this test condition, which was caused by “hyper-silanization”, and the electrodes were not available at this time.

4.2 能斯特斜率

本研究對制備的K+、Ca2+、H+、Cl-雙管ISME的能斯特斜率進行測試，其結果如表3所示。由于溫度的變化會對實際測得的電極能斯特斜率產生影響，此次試驗選定在室溫25 ℃下進行。此條件下一價離子的能斯特斜率理論值的絕對值為59.16 mV/dec，二價離子絕對值為29.28 mV/dec。當實測能斯特斜率達到理論能斯特斜率的90%時，一價離子實測能斯特斜率的絕對值不小于53.24 mV/dec，二價離子絕對值不小于26.35 mV/dec。由表3可知，利用文中方法制作的雙管ISME的實際能斯特斜率均可以到達理論值的90%以上，可以滿足植物細胞外離子流速和細胞內離子活度的測量要求。表3中離子選擇性微電極的實際能斯特斜率低于理論值的原因，是由于離子選擇性微電極雖然對某種離子具有選擇性，但并非僅對特定離子具有選擇性，即溶液中的同價離子也有可能被ISME檢測到，這些離子通常被稱為干擾離子。例如，K+選擇性電極對Na+也具有一定的選擇性，只是該電極對K+的選擇性更高。此外影響電極實際能斯特斜率的因素還有很多，例如室內溫度過高或過低都會影響電極的實際能斯特斜率。由于存在諸多因素的影響，從試驗中積累的經驗以及獲取的數據上看，對于實際能斯特斜率的絕對值而言，一價離子（55±5 mV/dec），二價離子（26 ±3 mV/dec）都是可接受的。

表3 雙管離子選擇性微電極的能斯特斜率測試結果

4.3 響應時間

響應時間的測試結果如表4所示。響應時間的最大值是決定離子選擇性微電極性能的重要因素。在進行離子流速測量時，電極響應時間越長，電極往復移動的時間間隔就會越大，電極的數據采集頻率就會越低，這勢必會影響到電活動快速變化時離子流速信息的記錄。因此，需要依據響應時間確定電極的振動頻率。試驗結果顯示，Ca2+選擇性電極測試時出現了最長的響應時間為0.42 s，因此電極在測試時的停留時間須高于0.42 s。目前文獻中使用SIET技術測試細胞外離子流速時，ISME的數據采集頻率為0.5 Hz[26-28]，對應的電極的往復移動周期為2 s，此時電極每次在2個固定點間的移動時長為1 s，在2個測量點的停留時間各為0.5 s（大于0.42 s），滿足本研究測試雙管離子選擇性電極對響應時間的要求。因此，使用雙管ISME測試離子流速時，0.5 Hz是一個較為合理的數據采集頻率。

表4 雙管離子選擇性微電極的響應時間測試結果

注：1～8為試驗次數，響應時間為從電極接觸溶液開始到接觸電位穩定所需時間的95%。

Note: 1-8 represent the number of tests. Responded time was 95% of the time from the start of the electrode contact with the solution to the stabilization of the contact potential.

5 結 論

本研究提出了一種簡易的雙管離子選擇性微電極制備方法，解決了傳統雙管離子選擇性微電極制備過程繁瑣、不易制備成功的難題。本研究的主要結論如下：

本研究詳細介紹了雙管微電極制備和電極尖端灌充液態離子交換劑的具體流程，并確定雙管微電極的最優硅烷化溫度、二甲基二氯硅烷劑量和硅烷化時間分別為150 ℃、45L和90 min。制備的雙管氫離子、鉀離子、鈣離子、氯離子選擇性微電極的能斯特斜率達到了54.08、56.51、27.08和-58.80 mV/dec，可以滿足離子選擇性電極使用要求；4種雙管ISME的響應時間介于0.20～0.42 s之間，并以此為依據確定了離子流速測量時電極的移動頻率（0.5 Hz）。將雙管離子選擇性微電極制備方法化繁為簡，有利于促進離子選擇性微電極技術在農業工程、作物育種、生理抗逆以及植物細胞營養等研究領域的廣泛應用。

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Preparation of double-barreled ion-selective microelectrodes

Li Jinhai1, Xue Lin2, Zhou Qiao1, Huang Lan1, Wang Zhongyi1※

(1.100083,; 2.100101,)

Ion-Selective Microelectrode (ISME) technology has widely been used to evaluate the plant electrical activity in mesoscopic space-time scale, including dynamic measurements on extracellular ion fluxes and intracellular ion activities. But the interference of electromigration or membrane potential changes has posed a great challenge on the traditional single-barreled ISME during the electrophysiological experiments, particularly on the accuracy of measured data. In this study, a double-barreled ISME monitoring scheme was proposed to eliminate the influence of potential drift on the measurement for more accurate information of ion flux. A simple and rapid preparation process of double-barreled ISMEs fabrication was also developed to widen the application of ion-selective electrode technology. Septum Theta (a borosilicate glass capillary with two cavities) was used to fabricate the improved double-barreled microelectrode during preparation, particularly on the silanization and liquid ion exchanger filling in the microelectrode tip of double-barreled ISME. The experimental measurements were conducted for the Nernst slope and response time of double-barreled ISMEs. A standardized feasibility plan was provided for the preparation and performance testing of double-barreled ISMEs. Experimental results showed that the optimal silanization temperature, dimethyldichlorosilane dosage, and silanization time were 150 ℃, 45L, and 90 min, respectively, when the double-barreled microelectrodes were silanized by the steam silane. In this case, the double-barreled ISME that filled 100m liquid ion exchanger in the tip was reciprocated in the test solution at a frequency of 0.5Hz for 30min, where the remaining amount of liquid ion exchanger was observed under the microscope. The remaining amount of liquid ion exchanger was (100±0)m in the double-barreled potassium ion, calcium ion, and hydrogen ISMEs’ tip. In double-barreled chlorine ISMEs, the remaining amount of liquid ion exchanger in the tip was (90±8.2)m. The Nernst slopes of double-barreled hydrogen ion, potassium ion, calcium ion, and chlorine ISMEs were 54.08, 56.51, 27.08, and -58.80 mV/dec, respectively. The measured Nernst slope of ISMEs was more than 90% of the theoretical value suitable for the requirements of the application. The response time of ion-selective electrodes with different liquid ion exchangers was between 0.2 and 0.42 s. Therefore, 0.5 Hz was a reasonable vibration frequency for the measurement of extracellular ion fluxes with the double-barreled ISMEs. The experimental results demonstrated that the double-barreled ISME developed by the improved preparation can well meet the requirements of ISME technology, thereby effectively capturing the extracellular ion fluxes or intracellular ion activities of plant cells. Consequently, the facile preparation of double-barreled ISME can be expected to greatly reduce the experimental difficulty of ISME fabrication. The finding can also provide a great contribution to acquire experimental data of plant physiological detection and applications in agricultural engineering, crop breeding, physiological stress tolerance, and cellular nutrition.

microelectrodes; test; double-barreled ion-selective microelectrodes; silanization; preparation method

李進海，薛琳，周橋，等. 雙管離子選擇性微電極制備方法研究[J]. 農業工程學報，2021，37(16)：24-30.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.004 http://www.tcsae.org

Li Jinhai, Xue Lin, Zhou Qiao, et al. Preparation of double-barreled ion-selective microelectrodes[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(16): 24-30. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.004 http://www.tcsae.org

2021-01-11

2021-05-11

國家自然科學基金項目（61571443）

李進海，博士生，研究方向為生物系統感測與智能裝備。Email：lijinhai@cau.edu.cn

王忠義，博士，教授，研究方向為生物系統感測與智能裝備。Email：wzyhl@cau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.004

O657.15

A

1002-6819(2021)-16-0024-07