孵化前期二氧化碳調(diào)控對(duì)蛋雞種蛋孵化胚胎的影響

童 勤，朱麗蓉，劉 暢，鄭煒超，韓勝強(qiáng),4，李 杜

·農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源工程·

孵化前期二氧化碳調(diào)控對(duì)蛋雞種蛋孵化胚胎的影響

童 勤1,2,3，朱麗蓉1,2，劉 暢1,2，鄭煒超1,2,3※，韓勝強(qiáng)1,2,4，李 杜5

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)水利與土木工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3. 北京市畜禽健康養(yǎng)殖環(huán)境工程技術(shù)研究中心，北京 100083；4. 江蘇立華牧業(yè)股份有限公司，常州 213168；5. 北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101206）

為探究孵化前期高濃度CO2調(diào)控對(duì)蛋雞種蛋孵化的影響機(jī)制，該研究以京紅1號(hào)蛋雞種蛋為試驗(yàn)對(duì)象，在孵化前期（0～10 d）處理組通過補(bǔ)充CO2的方式保持CO2濃度1%，對(duì)照組CO2濃度小于0.25%，對(duì)比研究了1% CO2濃度處理對(duì)種蛋孵化的影響。結(jié)果表明，CO2處理組與對(duì)照組的受精蛋孵化率無顯著性差異（>0.05）；第9天和第12天CO2處理組的胚胎質(zhì)量和相對(duì)胚胎質(zhì)量顯著高于對(duì)照組（<0.05）；第3天、第6天和第9天CO2處理組的蛋白pH值顯著低于對(duì)照組（<0.05）；第11天，CO2處理組和對(duì)照組尿囊絨毛膜（CAM，Chorioallantoic Membrane）血管發(fā)育密度無顯著性差異（>0.05）；第0天、第6天、第12天兩組的蛋殼和胚胎鈣含量不存在顯著差異。在蛋雞種蛋孵化前期（0～10 d）保持1%濃度的CO2，降低了蛋白pH值，加速了胚胎發(fā)育，但未影響孵化率。

二氧化碳；動(dòng)物；孵化；胚胎發(fā)育；孵化率

0 引 言

孵化環(huán)境直接影響雛雞質(zhì)量，其中二氧化碳（CO2）作為重要的氣體環(huán)境因子，對(duì)家禽胚胎發(fā)育起重要作用[1-2]。在自然孵化過程中，母雞在孵化的前9 d集中孵蛋，種蛋周圍通風(fēng)較差，限制了胚胎早期的氧氣量，二氧化碳濃度可達(dá)到0.9%，氧氣濃度降為20.3%[3]。然而長(zhǎng)期以來，CO2被認(rèn)為是孵化的副產(chǎn)品，較高濃度的CO2不利于胚胎的發(fā)育[4-5]。因此現(xiàn)代巷道式孵化通常保持較高的通風(fēng)以將孵化器內(nèi)的CO2濃度保持在較低水平，這可能影響孵化質(zhì)量的提高，過度通風(fēng)換氣又造成了一定程度的能源浪費(fèi)。

近年來，研究人員開始關(guān)注在種蛋的孵化過程人工進(jìn)行CO2調(diào)控，以提高孵化質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，孵化前10 d通過減少通風(fēng)提高二氧化碳濃度，可以刺激胚胎生長(zhǎng)并提高孵化率[6-8]，且在胚胎發(fā)育后期，雞胚能夠耐受較高濃度的CO2[9]。Sadler等[10]以蛋雞種蛋（White Leghorns）為試驗(yàn)對(duì)象，在胚胎發(fā)育前48 h分別使用0%、1%、2%和4%濃度CO2處理，在48 h使用10倍放大的解剖鏡觀察胚胎長(zhǎng)度與體節(jié)數(shù)，發(fā)現(xiàn)胚胎長(zhǎng)度和平均體節(jié)數(shù)隨著CO2濃度增加而增加。Bruggeman等[11]使用43周齡的肉雞（Cobb）種蛋，處理組CO2濃度在胚胎發(fā)育的第25～96 h逐漸上升至1.5%，保持1.5%持續(xù)到第10天（240 h），發(fā)現(xiàn)處理組的胚胎質(zhì)量有更高的趨勢(shì)，尤其在第6天和第10天差異顯著。Willemsen等[12]使用肉雞（Cobb）種蛋，在胚胎發(fā)育的前10 d，以減少通風(fēng)的方式使孵化箱內(nèi)CO2濃度緩慢提升至1%，發(fā)現(xiàn)CO2處理組的胚胎死亡率顯著下降。Tona等[13]使用肉雞（Ross）和蛋雞（Isa Brown）種蛋，在胚胎發(fā)育前10 d處理組中CO2濃度從0.05%增至1%，對(duì)照組始終保持在0.1%以下，發(fā)現(xiàn)CO2處理使得內(nèi)部啄殼時(shí)間、外部啄殼時(shí)間和出雛時(shí)間均縮短。以上研究表明孵化前10 d增加CO2濃度對(duì)胚胎發(fā)育有積極影響，但目前高濃度CO2調(diào)控對(duì)蛋雞種蛋孵化的影響機(jī)制尚不清楚。

胚胎在發(fā)育過程中有3種氣體交換方式：在胚胎發(fā)育0～4 d左右通過卵黃囊血管進(jìn)行氣體交換；尿囊絨毛膜（CAM，Chorioallantoic Membrane）血管，在胚胎發(fā)育第5天開始形成，第8天成為氣體交換的主要器官[6]；第19天左右，雛雞啄破內(nèi)殼膜，喙進(jìn)入氣室，尿囊絨毛膜血管退化，開始進(jìn)行肺呼吸[14]。長(zhǎng)時(shí)間暴露于低氧環(huán)境會(huì)促進(jìn)胚胎血管形成、心臟血液輸出量改變，促進(jìn)心血管發(fā)育，進(jìn)而可能會(huì)促進(jìn)胚胎代謝及發(fā)育[15]，前10 d高CO2濃度會(huì)使得O2濃度降低，進(jìn)而可能影響尿囊絨毛膜血管發(fā)育。CO2在蛋白中高溶解度，較高CO2水平在孵化早期使蛋白液化，蛋白pH值下降，這可能使得胚胎吸收更多營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)胚胎發(fā)育[16]。在胚胎的代謝中鈣是最重要的礦物質(zhì)，鈣從蛋殼轉(zhuǎn)移至胚胎中提供發(fā)育所需[17]。蛋內(nèi)容物和胚胎的鈣含量自孵化第12天起顯著上升，二氧化碳與水的作用可使蛋殼中碳酸鈣轉(zhuǎn)化成可溶的碳酸氫鈣，進(jìn)而更好的轉(zhuǎn)移鈣，這可能有利于胚胎發(fā)育。

本文以京紅1號(hào)蛋雞種蛋為試驗(yàn)對(duì)象，研究在胚胎發(fā)育前10 d保持1%濃度的CO2對(duì)種蛋孵化率和胚胎發(fā)育情況的影響，根據(jù)尿囊絨毛膜（CAM）血管發(fā)育情況、蛋白pH值變化、蛋殼和胚胎鈣含量變化，探究孵化前期CO2調(diào)控對(duì)蛋雞種蛋孵化的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 孵化箱與二氧化碳調(diào)控系統(tǒng)

本試驗(yàn)使用2臺(tái)相同的全自動(dòng)孵化器（OvaEasy 380 Advance EX Series II，Brinsea，英國(guó)），孵化器尺寸為800 mm×420 mm×820 mm（長(zhǎng)×寬×高），每臺(tái)孵化器可以孵化放300枚種蛋。兩臺(tái)孵化器放置于同一房間，室內(nèi)的通風(fēng)量設(shè)置為500 m3/h。本試驗(yàn)所用的全自動(dòng)孵化器在設(shè)置溫度和濕度等相關(guān)條件后，孵化期自動(dòng)調(diào)節(jié)通風(fēng)量。室內(nèi)裝有一臺(tái)2000 W的工業(yè)暖風(fēng)機(jī)（SY-N2KWPTC220，中國(guó)）作為熱源，工業(yè)暖風(fēng)機(jī)配備溫度控制器（MK-SM5，中國(guó)），調(diào)控精度為0.1 ℃，保證室內(nèi)溫度維持在25 ℃左右。室內(nèi)裝有一臺(tái)負(fù)壓風(fēng)機(jī)（SF-2.5-4管道式-380 V，中國(guó)），通風(fēng)量設(shè)置為500 m3/h，且室內(nèi)還配備一臺(tái)室內(nèi)循環(huán)風(fēng)機(jī)，用以保證室內(nèi)環(huán)境的均衡。試驗(yàn)開始前為每臺(tái)孵化器設(shè)計(jì)并構(gòu)建基于控制器ZK2N PLC的CO2動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，用于調(diào)控孵化箱內(nèi)CO2濃度，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境數(shù)據(jù)。具體方案如下：

1）使用濃度為99.999%的CO2氣瓶向孵化箱內(nèi)補(bǔ)充氣體，通過控制電磁閥的通閉時(shí)間調(diào)控CO2濃度。

2）孵化箱內(nèi)部上端安裝CO2傳感器、溫濕度傳感器、O2傳感器，孵化過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CO2、溫度、濕度、O2數(shù)值，并將電壓模擬信號(hào)傳送給CO2調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行處理。當(dāng)CO2傳感器所檢測(cè)信號(hào)低于設(shè)定值時(shí)，調(diào)控系統(tǒng)傳遞高電平給電磁閥，電磁閥打開，CO2進(jìn)行補(bǔ)充直至達(dá)到設(shè)定值。

3）通過觸摸屏（S430A）實(shí)現(xiàn)環(huán)境數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，使用Arduino SD模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲(chǔ)。

CO2調(diào)控系統(tǒng)以控制器（ZK2N PLC）為核心，由控制器、傳感器、上位機(jī)、存儲(chǔ)模塊、驅(qū)動(dòng)模塊、執(zhí)行機(jī)構(gòu)6部分組成，如圖1所示。

圖2為控制系統(tǒng)的流程圖，實(shí)現(xiàn)對(duì)CO2濃度的調(diào)控及CO2濃度、溫度、濕度和O2濃度的數(shù)據(jù)采集。ZK2NPLC的AD模擬量采用中斷輸入輸出模式，因此調(diào)控CO2濃度的同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和運(yùn)算。控制步驟如圖所示：首先控制器通電，控制器置初始狀態(tài)，緊接著將數(shù)據(jù)寄存器清零（數(shù)據(jù)計(jì)算、寄存）。將VAISALAGMP251 CO2傳感器的實(shí)時(shí)CO2數(shù)據(jù)與D100寄存器中的1% CO2濃度進(jìn)行比較，如果CO2濃度低于1% PLC則發(fā)出脈沖信號(hào)使固態(tài)繼電器置ON，隨后氣體電磁閥打開進(jìn)行CO2氣體補(bǔ)充，CO2濃度達(dá)到1%時(shí)停止氣體補(bǔ)充，至此完成一個(gè)控制循環(huán)。

1.2 孵化種蛋和試驗(yàn)處理

入孵當(dāng)天從孵化場(chǎng)選擇京紅1號(hào)28～50周齡的種蛋分3批次直接運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行孵化，運(yùn)輸過程中運(yùn)輸車內(nèi)溫度為18～20℃，濕度為60%～70%。種蛋在孵化場(chǎng)存儲(chǔ)1～3 d，保存溫度為22～23℃，濕度為65%～75%。將種蛋隨機(jī)分成2組，每組300枚，對(duì)照組平均蛋質(zhì)量為（60.72±3.50）g，處理組的平均蛋質(zhì)量為（61.06±3.62）g，將種蛋消毒后隨機(jī)放入2臺(tái)全自動(dòng)孵化器內(nèi)進(jìn)行孵化。處理組在孵化前10 d控制CO2濃度為1%，1%濃度CO2從孵化開始持續(xù)到孵化第10天（240 h），第240 h時(shí)停止補(bǔ)充CO2，整個(gè)孵化過程中對(duì)照組CO2濃度在0.25%以下。孵化箱溫度設(shè)置為37.6 ℃，相對(duì)濕度0～18 d為50%，19～21 d為60%。每90 min自動(dòng)翻蛋，角度為90°。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，為消除孵化箱對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，不同批次試驗(yàn)時(shí)2臺(tái)孵化箱交替用于處理組和對(duì)照組。

1.3 測(cè)試指標(biāo)

1）孵化率及雛雞質(zhì)量

512 h關(guān)閉孵化器，清點(diǎn)雛雞出殼數(shù)量，并計(jì)算孵化率，對(duì)處理組和對(duì)照組的所有雛雞進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，方法參考Tona等[18]研究。

受精蛋孵化率計(jì)算如下式所示：

2）胚胎發(fā)育

在第6天（144 h）、第9天（216 h）、第12天（288 h）、第15天（360 h）、第18天（432 h），分別隨機(jī)選取CO2處理組和對(duì)照組15枚種蛋，使用304不銹鋼開蛋器（K0154，中國(guó)）打開種蛋鈍端處蛋殼，取出胚胎吸水后使用電子天平（JM-0.001，中國(guó)）稱質(zhì)量。稱取胚胎絕對(duì)重量，計(jì)算公式如下：

3）尿囊絨毛膜（CAM）血管發(fā)育

在胚胎發(fā)育第11天（264 h），CO2處理組和對(duì)照組分別隨機(jī)取3枚發(fā)育正常的種蛋，參考Verhoelst等[19]方法分析尿囊絨毛膜血管發(fā)育情況。尿囊絨毛膜血管在第11天時(shí)完全附著在蛋殼內(nèi)表面，使用開蛋器打開種蛋鈍端處蛋殼，再用解剖針和手術(shù)剪（BY-3143，中國(guó)）去除種蛋蛋白、蛋黃和胚胎等內(nèi)容物，隨后在蛋殼內(nèi)充滿10 %的中性福爾馬林固定液（上海圻明生物科技有限公司，中國(guó)）并保持24 h，將紅細(xì)胞固定在血管中。固定24 h后，將種蛋排空并分成3段，使用微型切割機(jī)（MNT-995201B-786，中國(guó)）將中間段均分成8部分，如圖3a所示。

使用微距鏡頭（15×，對(duì)焦距離3～6 cm，BL-058，中國(guó)）對(duì)中間段每部分進(jìn)行拍照，將拍攝初始圖像裁剪成分辨率1 024×800（像素）的圖片，水平和垂直分辨率為96 dpi。用Image J（Rawak Software，Inc. 德國(guó)）首先將1 024×800（像素）圖片由RGB Color轉(zhuǎn)化成8-bit類型的圖片，然后用Trainable Weka Segmentation機(jī)器學(xué)習(xí)插件對(duì)血管和非血管背景進(jìn)行識(shí)別學(xué)習(xí)，最后再次將處理好的圖片由8-bit轉(zhuǎn)化成RGB Color，使用Threshold自動(dòng)計(jì)算出血管面積所占采樣蛋殼比例。

4）蛋白pH值

胚胎發(fā)育第0天（0 h）、第3天（72 h）、第6天（144 h）、第9天（216 h）、第12天（288 h）和第15天（360 h），分別隨機(jī)取CO2處理組和對(duì)照組15枚種蛋，使用304不銹鋼開蛋器打開種蛋鈍端處蛋殼，使用蛋白分離器分離出蛋白。使用高精度手持pH計(jì)（臺(tái)灣衡欣AZ8601，精度0.02，中國(guó)）檢測(cè)蛋白pH值。

5）蛋殼與胚胎鈣含量

在胚胎發(fā)育第0天、第6天和第12天，CO2處理組和對(duì)照組分別隨機(jī)取3枚種蛋，首先使用304不銹鋼開蛋器打開種蛋鈍端處蛋殼，配合使用解剖針和手術(shù)剪（BY-3143，中國(guó)）將胚胎和蛋殼進(jìn)行分離；稱取適量樣品至聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL硝酸靜置，反應(yīng)結(jié)束后密封放入微波消解儀（MILESTONE-ETHOS1，意大利），按照順序100 ℃保持3 min、140 ℃保持3 min、160 ℃保持3 min、180 ℃保持3 min、190 ℃保持15 min；待溫度冷卻至50 ℃以下，取出消解罐放入通風(fēng)櫥中，打開消解罐用超純水潤(rùn)洗，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用超純水稀釋至定容刻度，最后使用電感耦合等離子光譜儀（Perkin Elmer-optima 8000，美國(guó)）和鈣元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，中國(guó)）檢測(cè)樣品鈣含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用IBM SPSS Statistics 25.0（國(guó)際商業(yè)機(jī)器公司IBM，美國(guó)）和Microsoft Office Excel 2019（微軟股份有限公司 Microsoft Corporation，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。其中孵化率采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。采用混合模型對(duì)影響雞胚發(fā)育指標(biāo)的日齡、二氧化碳處理進(jìn)行主體效應(yīng)檢驗(yàn)，批次作為隨機(jī)效應(yīng)。其中，<0.05表示差異顯著。

一般線性模型1：

1+A+C+B+AC+AB+CB+（3）

式中1是胚胎質(zhì)量、相對(duì)胚胎質(zhì)量、pH值或鈣含量，是均值，是日齡（其中，當(dāng)1是胚胎質(zhì)量或相對(duì)胚胎質(zhì)量時(shí)，=6、9、12、15、18；當(dāng)1是pH值時(shí)，=0，3，6，9，12，15；當(dāng)1是鈣含量時(shí)，=0，6，12），是CO2處理（=處理組、對(duì)照組），是批次（=1、2、3），為誤差。

一般線性模型2：

2+C+B +CB+（4）

式中2是CAM比值。

文中的圖均使用Origin 2018（Origin Lab，美國(guó)）制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 孵化期CO2濃度

基于ZK2NPLC的CO2動(dòng)態(tài)調(diào)控及環(huán)境數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和基于Arduino的環(huán)境數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圖4為處理組和對(duì)照組孵化箱CO2濃度在基于ZK2NPLC的CO2動(dòng)態(tài)調(diào)控及環(huán)境數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)調(diào)控下的實(shí)際監(jiān)測(cè)值，整個(gè)孵化期對(duì)照組CO2濃度在0.25%以下，第0～10天CO2濃度理論值為1%，實(shí)際監(jiān)測(cè)值在（0.96±0.04）%之間，達(dá)到了預(yù)設(shè)的試驗(yàn)條件，孵化設(shè)備和CO2動(dòng)態(tài)調(diào)控及環(huán)境數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的所有設(shè)備運(yùn)行良好。

2.2 孵化率分析

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示CO2處理組和對(duì)照組的受精蛋孵化率分別為（89.17±2.53）%和（91.57±1.03）%，差異不顯著（>0.05）。處理組和對(duì)照組雛雞品質(zhì)評(píng)分為100分的占比分別為76.22%和74.05%，處理組和對(duì)照組雛雞品質(zhì)評(píng)分為90～100分的占比分別為18.68%和20.91%，處理組和對(duì)照組雛雞品質(zhì)評(píng)分為80～90分的占比分別為4.36%和3.97%，處理組和對(duì)照組雛雞品質(zhì)評(píng)分在80分以下的占比分別為0.74%和1.07%。本研究試驗(yàn)中早期胚胎可以耐受1%濃度CO2，孵化環(huán)境條件中O2濃度應(yīng)該是影響孵化率的關(guān)鍵，孵化前期處理組O2濃度維持在（20.2±0.1）%，該O2濃度不會(huì)對(duì)胚胎生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.3 胚胎發(fā)育分析

經(jīng)過6 d的發(fā)育，胚胎器官已經(jīng)形成，此時(shí)可以解剖分離稱質(zhì)量，從第6天開始測(cè)量胚胎質(zhì)量，在此后每隔2 d對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行跟蹤測(cè)試。胚胎質(zhì)量變化和相對(duì)胚胎質(zhì)量變化如圖5所示，處理組和對(duì)照組在第9天胚胎重分別為（1.747±0.177）g和（1.556±0.137）g，第12天分別為（5.182±0.491）g和（4.606±0.440）g；處理組和對(duì)照組在第9天相對(duì)胚胎重分別為（3.16±0.37）%和（2.83±0.28）%；第12天分別為（9.39±0.97）%和（8.51±0.76）%。在胚胎發(fā)育第9天和第12天，CO2處理組和對(duì)照組胚胎質(zhì)量和相對(duì)胚胎質(zhì)量存在顯著差異（<0.05）；在胚胎發(fā)育第6天、第15天和第18天，CO2處理和對(duì)照組胚胎質(zhì)量和相對(duì)胚胎質(zhì)量無顯著性差異（>0.05）。

2.4 尿囊絨毛膜（CAM）血管發(fā)育分析

對(duì)CO2處理組和空白對(duì)照組的各24個(gè)尿囊絨毛膜血管樣品進(jìn)行圖像分析，CO2處理組和對(duì)照組的血管比例分別為（11.81±2.41）%和（11.74±2.31）%，兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不存在顯著性差異（>0.05）。

2.5 蛋白pH值分析

統(tǒng)計(jì)分析顯示日齡和處理組對(duì)蛋白pH值影響顯著（<0.05）。前期研究表明在孵化第1～3天蛋白pH值會(huì)顯著升高隨后逐漸降低，蛋白從第12～13天開始被吸收，到孵化的第16天被吸收完[20]。本研究從孵化第0天開始每隔2 d對(duì)蛋白pH值進(jìn)行跟蹤測(cè)試，種蛋的蛋白pH值的變化如圖6所示。隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，蛋白pH值整體變化趨勢(shì)為先升高后降低，第3天達(dá)到峰值。第3天、第6天和第9天CO2處理組的蛋白pH值分別是8.82±0.19，8.20±0.20和7.85±0.19，對(duì)照組的蛋白pH值分別是9.27±0.13，8.56±0.24和8.21±0.29。CO2處理組蛋白pH值整體低于處理組，且在第3天，第6天和第9天存在顯著差異（<0.05）。

圖6 蛋白pH值變化

2.6 蛋殼鈣與胚胎鈣含量分析

經(jīng)過6 d的發(fā)育，胚胎器官已經(jīng)形成，此時(shí)采集胚胎樣品對(duì)鈣含量進(jìn)行檢測(cè)，跟蹤充CO2前后鈣含量變化。在胚胎發(fā)育第0天測(cè)試種蛋蛋殼鈣含量，在第6天和第12天測(cè)試胚胎和種蛋蛋殼的鈣含量，結(jié)果如表 1所示，統(tǒng)計(jì)分析顯示日齡和處理組對(duì)蛋殼鈣含量影響不顯著（>0.166），日齡對(duì)胚胎鈣含量影響顯著（=0.014），處理組對(duì)胚胎鈣含量影響不顯著（=0.143）。從第0天到第12天蛋殼鈣含量變化不大，且處理組和對(duì)照組的差異不顯著（>0.05）；第12天胚胎的鈣含量顯著高于第6天（<0.05），而孵化同一時(shí)期處理組和對(duì)照組胚胎的鈣含量不存在顯著差異（>0.05）。

表1 不同天數(shù)的蛋殼和胚胎鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：同一組不同字母代表不同天數(shù)的數(shù)據(jù)有顯著性差異。

Note: There are significant differences in data that the same group of different letters mark represents different days.

3 討 論

在Taylor等[21-22]的研究中，在胚胎發(fā)育的0～4 d，CO2濃度在0～1%時(shí)對(duì)孵化率無影響，當(dāng)CO2濃度高于1.1%時(shí)，孵化率會(huì)顯著降低；胚胎發(fā)育的5～8 d，CO2濃度高于3%會(huì)顯著降低孵化率；胚胎發(fā)育的9～12 d，CO2濃度高于5%會(huì)顯著降低孵化率。Sadler等[10]研究中，第10～21天CO2濃度從1%逐漸升至5%對(duì)孵化率無顯著性影響。Gildersleeve[6]使用火雞種蛋在胚胎發(fā)育的0～10 d保持0.3%濃度的CO2，相對(duì)于對(duì)照組0.1% CO2濃度，孵化率顯著提高，這與Taylor等[21-22]和Sadler等[10]的研究結(jié)果不一致，造成這種現(xiàn)象可能與物種差異有關(guān)，因?yàn)樽匀环趸仓蠧O2濃度在不同物種間變化很大。De Smit等[23]在胚胎發(fā)育0～10 d通過減少通風(fēng)的方式提高孵化器內(nèi)CO2濃度至1.5%，與對(duì)照組相比孵化率無顯著性差異。上述研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致，孵化前期高濃度CO2不會(huì)影響孵化率，說明早期胚胎可以耐受1%濃度CO2。

Bruggeman等[11]在胚胎發(fā)育第25～96小時(shí)，將孵化器內(nèi)CO2濃度提升至1.5%左右，保持CO2濃度直到240 h，加速了胚胎發(fā)育，在第6天和第9天CO2處理組胚胎重量顯著高于對(duì)照組。De Smit等[23]在胚胎發(fā)育過程中減少通風(fēng)，處理組在前10 d緩慢上升至0.7%，觀察到胚胎發(fā)育的第10～18天，處理組的胚胎平均重量顯著大于對(duì)照組（CO2濃度小于0.1%）。本研究表明孵化前期（0～10 天）采用1%濃度的CO2處理會(huì)加速中期胚胎發(fā)育。孵化前期，胚胎主要利用蛋白中的蛋白質(zhì)，前期補(bǔ)充CO2使蛋白液化可能促進(jìn)了胚胎從蛋白吸收營(yíng)養(yǎng)，從而加速了胚胎發(fā)育。第12天時(shí)，雞胚消化系統(tǒng)發(fā)育完全，隨著胚胎的發(fā)育，卵黃中的蛋白成為胚胎蛋白質(zhì)的主要來源。處理組停止補(bǔ)充CO2后，隨后兩組的胚胎發(fā)育的顯著性差異消失。

尿囊絨毛膜（CAM）血管是胚胎發(fā)育過程中的呼吸器官，是不同氣體濃度條件下胚胎發(fā)育的重要參考，其發(fā)育情況可能會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育、胚胎健康狀況產(chǎn)生影響[12]。孵化約100 h絨毛膜和尿囊膜融合時(shí)CAM血管開始形成，第6天CAM血管與內(nèi)殼膜接觸，第11天CAM血管完全附著在蛋殼內(nèi)表面，此時(shí)采樣對(duì)CAM血管的干擾最小，能夠觀察到發(fā)育中完整的CAM血管，到第12天CAM血管延伸到內(nèi)殼膜的整個(gè)表面，此時(shí)發(fā)育完全[19]。Dusseau等[24]在胚胎發(fā)育第7～10天，處理組使用15%濃度O2、85%濃度N2的氣體環(huán)境，對(duì)照組使用21%濃度O2（室內(nèi)空氣）的氣體環(huán)境，發(fā)現(xiàn)處理組尿囊絨毛膜血管密度顯著性大于對(duì)照組（P<0.05）。在醫(yī)學(xué)研究中缺氧是明確的血管生成刺激物，Bradbury等[25]研究表明，胚胎缺氧時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1）刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，vascular endothelial growth factor）的形成，進(jìn)而刺激血管生成。本研究表明，在胚胎發(fā)育的第0～10天1%濃度CO2處理對(duì)尿囊絨毛膜血管發(fā)育無顯著影響。在低氧環(huán)境下孵化的雞胚尿囊絨毛膜血管有增生反應(yīng)，使得血管密度增加的啟動(dòng)信號(hào)最有可能是氧氣供應(yīng)減少，本研究采用補(bǔ)充CO2的方式，孵化前期處理組O2濃度維持在（20.2±0.1）%，可能該O2濃度尚不足以引起尿囊絨毛膜血管增生的反應(yīng)。

Johnston等[29]研究了蛋殼、蛋白和蛋黃中的鈣分布及其在胚胎發(fā)育中的貢獻(xiàn)，胚胎發(fā)育前9天蛋黃和蛋白是胚胎鈣的主要來源，之后胚胎骨骼開始形成，蛋殼鈣成為胚胎發(fā)育的主要來源。由于環(huán)境CO2濃度的升高使得蛋白pH值降低，這可能為促進(jìn)蛋殼中鈣向胚胎轉(zhuǎn)移提供一種有利的環(huán)境[30]。然而本研究中處理組的蛋殼和胚胎鈣含量與對(duì)照組無顯著差異。這可能是由于在孵化前期胚胎處于卵裂及器官形成期，所需鈣含量較少，由卵內(nèi)容物提供即可滿足生長(zhǎng)發(fā)育需求，此時(shí)期由于蛋殼不是胚胎發(fā)育的主要鈣源，因此蛋殼的鈣變化較小。房興堂等[31]研究了不同胚齡烏骨雞胚胎鈣含量變化表明在胚胎發(fā)育第6天、第12天、第18天和第21天烏骨雞胚胎鈣含量分別為32.96、88.97、1164.4、2626.9 mg/kg，隨著發(fā)育的進(jìn)行胚胎中鈣的含量不斷增加，而且發(fā)育后期胚胎鈣含量增加的總量大大增加。本研究中第12天胚胎鈣含量高于第6天，也呈現(xiàn)顯著的增長(zhǎng)。第12胚齡鈣的轉(zhuǎn)移是重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)，這時(shí)候蛋殼開始為胚胎發(fā)育提供鈣，為出殼后的雛雞發(fā)育提供所需要的鈣。

4 結(jié) 論

本研究以28～50周齡的蛋雞（京紅1號(hào)）種蛋為試驗(yàn)對(duì)象，構(gòu)建了孵化箱CO2調(diào)控系統(tǒng)，研究了孵化前期（0～10 d）1%濃度的CO2調(diào)控對(duì)蛋雞孵化的影響，主要結(jié)論如下：

1）CO2處理組和對(duì)照組的受精蛋孵化率分別為（89.17±2.53）%和（91.57±1.03）%，差異不顯著（>0.05）。孵化前期（0～10 d）1%濃度CO2調(diào)控未對(duì)孵化率產(chǎn)生不良影響。

2）孵化前期（0～10）d 1%濃度CO2調(diào)控加速了早期胚胎發(fā)育，處理組和對(duì)照組在第9天胚胎質(zhì)量分別為（1.747±0.177）g和（1.556±0.137）g，第12天分別為（5.182±0.491）g和（4.606±0.440）g；處理組和對(duì)照組在第9天相對(duì)胚胎質(zhì)量分別為（3.16±0.37）%和（2.83±0.28）%；第12天分別為（9.39±0.97）%和（8.51±0.76）%。處理組的胚胎質(zhì)量和相對(duì)胚胎質(zhì)量在第9天和第12天顯著高于對(duì)照組。

3）第3天、第6天和第9天CO2處理組的蛋白pH值分別是8.82±0.19，8.20±0.20和7.85±0.19，對(duì)照組的蛋白pH值分別是9.27±0.13，8.56±0.24和8.21±0.29。第3天、第6天和第9天CO2處理組的蛋白pH值顯著低于對(duì)照組。CO2會(huì)使蛋白液化，加速了胚胎對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

綜上所述，在蛋雞種蛋孵化前期（0～10 d）保持1%濃度的CO2，加速了胚胎發(fā)育，但未影響孵化率；CO2處理降低了蛋白pH值，可能加快了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，促進(jìn)了胚胎發(fā)育。

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Effects of carbon dioxide regulation during early incubation stage on the hatching embryos of layer eggs

Tong Qin1,2,3，Zhu Lirong1,2，Liu Chang1,2，Zheng Weichao1,2,3※，Han Shengqiang1,2,4，Li Du5

(1,,100083,2,,100083,3,100083,4,.,213168,5,,101206,)

Environmental parameters generally determine the incubation performance and chick quality, one of which is carbon dioxide (CO2). However, the mechanism still remains unclear, particularly the effects of high CO2levels during early incubation on the hatching quality. In this study, three batches of fertile eggs from Jinghong No. 1 were incubated in two small-scale incubators, in order to investigate the influence of normal and higher CO2levels during the early stage of incubation (0-10 d). The treatment and control incubator maintained the CO2concentration of 1% and below 0.25%, respectively. The incubators were also swapped for the next batch. A higher CO2level was controlled during the incubation using a purpose-built system with CO2sensors and a CO2gas adding unit. The specific parameters were measured, including hatchability, chick quality, embryo weight, and relative embryo weight at the 6th, 9th, 12th, 15th, and 18thday, vascular development density of allantoic chorion (CAM) at day 11, albumen pH at day 0, day 3, day 6, day 9, day 12 and day 15, and the calcium content of eggshells and embryos at day 0, day 6 and day 12. The results showed that the CO2concentrations in the treatment and control incubator were achieved the target levels of about (0.96±0.04)%, lower than 0.25%. There was no significant difference between the two groups in hatchability and fertilized egg hatchability, where were (89.17±2.53)% and (91.57±1.03)% in the treatment and control group, respectively. Moreover, the higher CO2during early stage did not have much effect on the chick quality. The vascular development density of CAM on the 11thday had no significant difference between the treated and control groups, because the O2concentration was maintained around (20.2±0.1)%. There was also no significant difference in the calcium content of eggshells and embryos in the treated and control groups005, but the calcium content of embryos increased significantly from day 6 to day 12 in both groups (<0.05). However, the embryo weight and relative embryo weight in the treatment group were significantly higher than those in the control group on the 9thand 12thday (<0.05), but they were not consistent on day 6, day 15, and day 18 (>0.05). The effect of higher CO2on the embryo weight only occurred around the final stage of CO2stimulation. The reason was that the liquefaction of protein by CO2contributed greatly to promote the embryo absorption of nutrients from the protein, thereby accelerating embryonic development. But the effects just remained for a short term, until the CO2level was lower. Furthermore, the albumen pH in the treatment group was lower than that in the control group, due mainly to the higher external CO2level, particularly the significant differences on the 3rd, 6th, and 9thdays. The overall change trend of protein pH value increased first and then decreased, finally reaching the peak on day 3. Consequently, 1% CO2treatment during the early stage of incubation (0-10 d) lowered the protein pH, while accelerated the embryo development without affecting the hatchability and chick quality.

carbon dioxide; animals; hatching; embryonic development; hatchability

童勤，朱麗蓉，劉暢，等. 孵化前期二氧化碳調(diào)控對(duì)蛋雞種蛋孵化胚胎的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(16)：177-183.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.022 http://www.tcsae.org

Tong Qin，Zhu Lirong，Liu Chang, et al. Effects of carbon dioxide regulation during early incubation stage on the hatching embryos of layer eggs[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(16): 177-183. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.022 http://www.tcsae.org

2021-05-27

2021-07-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（31802109）

童勤，博士，副教授，研究方向?yàn)樾笄莪h(huán)境控制。Email：tongqin@cau.edu.cn

鄭煒超，博士，副教授，研究方向?yàn)樾笄菰O(shè)施養(yǎng)殖工藝與環(huán)境控制。Email：weichaozheng@cau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.022

S8

A

1002-6819(2021)-16-0177-07