斑蝥素酸鎂對SMMC-7721肝癌細胞Warburg效應的影響

朱順昕， 黃渝茜， 劉 云， 劉 流， 劉美辰， 李曉飛,3， 晏 容,3*

(1.遵義醫科大學基礎醫學院，貴州 遵義 563000；2.贛南衛生健康職業學院，江西 贛州 341000；3.遵義醫科大學貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義 563000；4.遵義醫科大學醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563000)

斑蝥是一類重要的抗癌昆蟲藥物，隸屬于芫菁科斑芫菁屬Meloidae，Mylabris，常被用于治療多種癌癥，特別是對原發性肝癌有特效。我們的前期研究已證實抗癌中藥斑蝥體內除了含有斑蝥素以外，還存在大量的斑蝥素鹽類物質(如斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣等)[1-2]，且體內外實驗證實斑蝥素酸鎂抑制肝癌細胞增殖的效果明顯優于斑蝥素和其它斑蝥素鹽類衍生物[3-5]。在此基礎上，課題組利用RNA-seq技術檢測斑蝥素酸鎂干預肝癌細胞SMMC-7721后的轉錄組變化，結果發現斑蝥素酸鎂可下調SMMC-7721細胞PI3K、Akt的mRNA表達[6]。提示斑蝥素酸鎂對肝癌細胞的增殖抑制作用可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

研究表明，過度增殖是腫瘤細胞重要的惡性行為之一，其多數腫瘤細胞增殖過程中需要攝取的大量能量主要來源于有氧糖酵解(Warburg效應)。PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路作為惡性腫瘤細胞Warburg效應最重要的調控通路之一，能夠介導腫瘤細胞糖酵解的發生[7-10]。那么抗癌中藥斑蝥素酸鎂抑制肝癌細胞增殖是否也與Warburg效應有關，其初步的調控機制如何？基于此，本實驗以促進肝癌細胞增殖的岡田酸為對照，探討斑蝥素酸鎂是否可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路影響肝癌細胞的Warburg效應，進而抑制腫瘤細胞增殖，發揮抗肝癌作用。

1 材料

1.1 試劑與藥物 斑蝥素酸鎂是將斑蝥素與氫氧化鎂反應制備而來，干燥后得到白色結晶粉末,純度在90%以上；斑蝥素酸鎂由課題組自主合成，制備方法已授權國家發明專利(ZL201110149288.5)[11]。SMMC-7721人肝癌細胞株由本實驗室保存，并由上海吉凱基因化學技術有限公司進行短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)種源鑒定。岡田酸購自美國Sigma公司，批號SLBV0493；胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI-1640培養基購自美國HyClone公司；葡萄糖攝取率檢測試劑盒購自美國Abnova公司；乳酸水平檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、0.25%胰蛋白酶、Goat anti-Rabbit IgG、Akt、p-Akt購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；PI3K、p-PI3K、GLUT1、LDHA購自英國Abcam公司；mTOR、p-mTOR購自美國CST公司。

1.2 儀器 311型CO2培養箱、Multiskan spectrum全波長酶標儀購自美國Thermo公司；超凈工作臺購自蘇州智凈凈化設備有限公司；mini protean 3 cell 電泳儀購自美國Bio-Rad公司；SP-9型電轉儀購自大連競邁生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養 SMMC-7721細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的完全培養基(RPMI-1640)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，待細胞在培養瓶長成致密單層時用于后續實驗。

2.2 分組 將細胞隨機分為空白對照組、岡田酸組、斑蝥素酸鎂(1/2IC50)組、斑蝥素酸鎂(IC50)組、斑蝥素酸鎂(2IC50)組，其中岡田酸濃度為0.059 nmol/L，斑蝥素酸鎂IC50為2.26 μmol/L[5]。

2.3 葡萄糖攝取率檢測 取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×104/mL，按照每孔100 μL將細胞均勻接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。次日待細胞貼壁后，加入不同濃度(4.52、2.26、1.13 μmol/L)斑蝥素酸鎂及岡田酸(0.059 nmol/L)，空白對照組加入等體積RPMI-1640細胞培養基，每組設置3個復孔，在37 ℃、5% CO2下培養24 h，收集細胞培養液，2 500 r/min離心10 min，取上清，按照試劑一(R1)-試劑二(R2)(1∶1)的比例進行配制，參照葡萄糖攝取率檢測試劑盒進行操作，混勻后，在37 ℃下保溫5 min，酶標儀在570、610 nm波長處測定各孔光密度(OD)，計算培養基中葡萄糖攝取率，公式為攝取率=(OD570 nm/OD610 nm)×100%。

2.4 乳酸生成量檢測 細胞分組、加藥處理同“2.3”項，培養24 h后收集細胞培養液，2 500 r/min離心10 min，取上清，按照乳酸測定試劑盒說明書進行操作，混勻后，雙蒸餾水調零，于530 nm波長處測定各管光密度(OD)，計算培養基中乳酸濃度，公式為乳酸濃度=[(測定OD-空白OD)/(標準OD-空白OD)]×標準品濃度(3 mmol/L)×樣本測試前稀釋濃度。

2.5 Western blot檢測 取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/mL，按照每孔2 mL將細胞均勻種于6孔板，置于培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，加入不同濃度斑蝥素酸鎂(4.52、2.26、1.13 μmol/L)及岡田酸(0.059 nmol/L)，空白對照組加入等體積的RPMI-1640細胞培養基，每組設置3個復孔，在37 ℃、5% CO2下培養24 h，棄上清，收集細胞，RIPA裂解，提取蛋白，BCA定量，樣品蛋白終質量濃度為5 μg/μL，進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干式電轉至硝酸纖維素膜后室溫封閉2 h，一抗兔抗GAPDH(1∶1 000)、GLUT1(1∶100 000)、LDHA(1∶5 000)、PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，HRP標記羊抗兔二抗(1∶10 000)在37 ℃下孵育1 h，TBST再漂洗3次，每次5 min，將其浸于發光液中2 min，并拍照成像，Tanon GIS軟件進行灰度分析。

3 結果

3.1 葡萄糖攝取率、乳酸生成量 如圖1～2所示，與空白對照組比較，斑蝥素酸鎂組葡萄糖攝取率、乳酸生成量降低(P<0.01)，并呈濃度依賴性,而岡田酸組兩者升高(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

3.2 GLUT1、LDHA蛋白表達 如圖3所示，斑蝥素酸鎂組GLUT1、LDHA蛋白表達低于空白對照組(P<0.01)，并呈濃度依賴性，而岡田酸組兩者表達高于空白對照組(P<0.01)。

注：A為GLUT1和LDHA蛋白條帶圖，B為各組GLUT1蛋白表達，C為各組LDHA蛋白表達。與空白對照組比較，**P<0.01。

3.3 PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化表達檢測 如圖4所示，與空白對照組比較，斑蝥素酸鎂組PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化表達降低(P<0.01)，并呈濃度依賴性，而岡田酸組三者磷酸化表達升高(P<0.01)。

注：A為PI3K、Akt、mTOR蛋白及其磷酸化蛋白條帶圖，B為各組PI3K蛋白磷酸化表達，C為各組Akt蛋白磷酸化表達，D為各組mTOR蛋白磷酸化表達。與空白對照組比較，**P<0.01。

4 討論

腫瘤是對人類健康危害最大的疾病之一，其同時也是造成全球范圍內疾病負擔的重要原因[12]。過度增殖是腫瘤細胞重要的惡性行為之一，腫瘤細胞增殖過程中需要攝取大量能量，其主要來源于有氧糖酵解，即腫瘤細胞即使在氧氣充足的情況下，仍依賴于糖酵解生成乳酸的方式進行無氧供能,又稱Warburg效應[13-14]。Warburg效應在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[15-17]。例如肝癌細胞可充分利用糖酵解過程中產生的ATP和中間代謝產物，以供其快速生長[18]。本實驗發現，與岡田酸組不同的是，斑蝥素酸鎂組的葡萄糖攝取率和乳酸生成量降低，提示斑蝥素酸鎂能減弱肝癌細胞的Warburg效應，進而抑制腫瘤細胞的增殖。

課題組通過前期的RNA-seq分析，并結合本實驗的Western blot檢測，結果發現斑蝥素酸鎂抑制肝癌細胞增殖與PI3K/Akt/mTOR信號通路失活有關。PI3K/Akt/mTOR信號通路作為惡性腫瘤細胞Warburg效應最重要的調控通路之一，能夠介導腫瘤細胞糖酵解的發生[7-10]。其機制一方面是PI3K磷酸化活化Akt，活化的Akt引起GLUT1向細胞膜轉移并激活GLUT1，增加葡萄糖的攝取；另一方面隨著PI3K/Akt被激活，mTOR的Ser2 448位點被磷酸化，活化的mTOR使腫瘤細胞中缺氧誘導因子HIF-1α激活，從而促進LDHA等多個編碼糖酵解酶的基因轉錄，提高了糖酵解水平，進而使葡萄糖消耗增加，并轉化為乳酸[19-22]。而抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路則可降低糖酵解水平，例如文獻[7]報道，PI3K/Akt/mTOR信號通路失活后結腸癌細胞中HIF-1α下調，導致糖酵解相關蛋白GLUT1、LDHA的表達降低，糖酵解代謝產物乳酸濃度降低。本研究結果與之相符，即斑蝥素酸鎂組的GLUT1和LDHA蛋白表達與空白對照組比較降低。其中GLUT1作為最常見的葡萄糖轉運蛋白，在細胞轉運葡萄糖跨膜進入胞質的過程中起到了重要作用，影響葡萄糖的攝取；LDHA作為重要的糖酵解酶，則參與了糖酵解過程中乳酸的形成。本實驗中葡萄糖攝取率和乳酸生成量的變化分別與GLUT1和LDHA蛋白表達變化一致。

綜上所述，與促進肝癌細胞增殖的岡田酸不同的是，斑蝥素酸鎂可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路，下調GLUT1和LDHA表達，減少葡萄糖的攝取和糖酵解代謝產物乳酸生成量，使Warburg效應減弱，最終抑制SMMC-7721肝癌細胞增殖。但對于斑蝥素酸鎂是否靶向抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路繼而調控Warburg效應還有待深入研究。下一步本課題組將利用PI3K/Akt/mTOR激動劑，觀察斑蝥素酸鎂對PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路及Warburg效應的影響，明確其具體調控機制，為斑蝥素酸鎂抗肝癌機制的深入研究提供理論依據。