電離輻射對斷乳期小鼠脾臟發育的影響研究

鄭宇棟，劉元朵，王長征，黃江榮，劉 蓮

(1.長江大學醫學部基礎醫學院，湖北 荊州 434023；2.長江大學第二臨床醫學院，湖北 荊州 434023)

環境中電離輻射的來源主要包括天然本底輻射、核泄漏及醫療環境輻射。醫療環境輻射已成為公眾輻射的主要來源，且主要為X射線。研究證實，電離輻射除了可造成神經系統[1]、心血管系統[2]損傷外，對于免疫系統[3]和造血系統[4]的影響也十分明顯。

脾臟作為人體較為關鍵的造血免疫器官，除具有廣泛的免疫功能外，在造血和紅細胞清除中也起著重要的作用，是輻射損傷最常見的器官之一[5]。有研究發現，3 Gy的輻射即可降低成年小鼠脾臟指數及外周血象中的白細胞數量[6]。目前研究多關注于輻射對成年小鼠脾臟的影響，而輻射對斷乳期小鼠脾臟的生長狀態及功能的影響研究甚少。

電離輻射致損傷的眾多靶點中，DNA是輻射損傷的主要目標。DNA損傷形成后，可激活細胞內DNA損傷應答調控反應，維持基因組的穩定性[7]。組蛋白H2AX在分子對DNA損傷應答反應中起著至關重要的作用[8]。DNA雙鏈斷裂(DSBs)發生后,其磷酸化產生的γ-H2AX可以及時反映DNA損傷程度和修復情況。此前研究發現γ射線可誘導人淋巴細胞中H2AX磷酸化蛋白的表達增加[9]，然而輻射對脾臟組織中H2AX表達及其影響目前甚少報道。本研究探究了X射線輻射對斷乳期小鼠脾臟生長狀態和功能的影響及可能的機制，以期為急性電離輻射損傷動物模型的建立和輻射防護提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級21日齡健康C57BL/6J小鼠14只[北京市實驗動物研究中心，動物合格證號:SCXK(京)2016-0006]，醫用電子直線加速器(Elekta，英國)，CM1950冷凍切片機(Leica，德國)，DM LB2顯微鏡(Leica，德國)，全自動血細胞分析儀(Olympus AU，日本)，GelDoc XR凝膠成像系統(BIO-RAD，美國)，全波長酶標儀(Thermo，美國)，BBY24 M全自動組織破碎儀(NESTADVANCE，美國)，ML-204電子分析天平(Mettler Toledo，美國)，渦旋混合器(金壇市醫療儀器廠，中國)，電熱恒溫干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司，中國)，β-actin抗體、H2AX抗體(Cell Signaling Technology，美國)，羊抗鼠抗體(Invitrogen，美國)，羊抗兔抗體(Jackson，美國)，ABC試劑盒、DAB試劑盒(Vector，美國)，RIPA裂解液、PMSF(大連美侖生物技術有限公司，中國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司，中國)，磷酸酶抑制劑(普利萊基因技術有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1小鼠輻射模型建立及取材

健康C57BL/6J小鼠14只，21日齡，SPF級，飼養環境溫度為(25±0.5)℃，相對濕度為(60±1)%，自由進食水。小鼠隨機分為假照射組、5 Gy照射組。照射時，將小鼠置入有機玻璃盒內，不含金屬物質，照射組以5 Gy的劑量(劑量率：4.23 Gy/min)進行全身X射線急性照射，源頭到動物的距離是100 cm。于照射后第7天，戊巴比妥鈉麻醉，取血，處死動物并取材。實驗經過長江大學醫學部倫理委員會審核，均遵守實驗動物飼養和使用原則。

1.2.2小鼠體重及臟器指數測定

稱取小鼠的體重，以戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉后處死動物，立即解剖將其脾臟取出，用吸水紙吸去污血，置于電子分析天平上稱量脾臟重量(mg)，計算脾臟指數，脾臟指數=脾重(mg)/體重(g)×10。

1.2.3小鼠外周血象檢測

小鼠摘除眼球采血，加入含有抗凝劑 EDTA-Na 的真空采血管，用全自動血細胞分析儀進行白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血小板計數(PLT)及血紅蛋白含量(HGB)的測量。

1.2.4免疫組化檢測脾臟中H2AX蛋白含量

將脾臟組織浸泡于4%的甲醛中，24 h后換至30%的蔗糖溶液。沉底后放入液氮速凍，迅速取出用OCT包埋放入冰凍切片機內，冰凍后行連續切片，層厚50 μm。將切好的組織切片用畫筆小心移到12孔板中，并分別加入30%的雙氧水，室溫0.5 h，PBST洗滌，血清室溫震蕩孵育 2 h，加入H2AX抗體(1∶500)，4 ℃搖床過夜，PBST洗滌，二抗室溫孵育1 h，PBST洗滌，加入AB液孵育0.5 h，DAB顯色。

1.2.5Western蛋白印跡檢測脾臟中H2AX蛋白含量

處死小鼠后迅速剝離脾臟，取脾臟準確稱重并加入RIPA蛋白裂解液在組織破碎儀中破碎，破碎完成后在冰上靜置裂解30 min，12 000 rpm離心20分鐘取蛋白上清。蛋白定量變性后進行常規電泳，轉膜，封閉后分別加入H2AX抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗滌，加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫1 h，化學發光顯色。

1.3 圖像分析和統計學方法

免疫組織圖片采用Image pro plus軟件進行平均光密度分析，WB蛋白條帶采用Image J軟件進行灰度分析。所有數據使用Prism 6 軟件統計分析，以均值±單次測量標準差表示，組間比較用單樣本t檢驗、雙因素方差分析F檢驗及 Bonferroni Post Hoc 檢驗，p<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠生理情況

照射前，各組小鼠健康狀況和精神狀態良好，飲食飲水正常；進行照射及假照射處理7天后，相比于對照組，照射組小鼠毛色黯淡，毛較為稀疏，精神不振。

2.2 電離輻射對小鼠脾臟的影響

與對照組相比，出生21天小鼠，經5 Gy照射7天后，脾臟體積顯著減小(圖1)，體重及脾臟重量顯著下降(p<0.01，p<0.01)，脾臟指數未見明顯改變(p>0.05)(表1)。

C—對照組小鼠脾臟；IR—照后7天小鼠脾臟。圖1 脾臟形態學變化Fig.1 Morphological changes of spleen

表1 輻射對小鼠體重、脾重、脾臟指數影響Tab.1 Effects of radiation on body weight,spleen weight and spleen indicators in mice

2.3 電離輻射對小鼠外周血象的影響

與對照組相比，出生21天小鼠，經5 Gy照射后，WBC(p<0.01)、PLT(p<0.05)、RBC(p<0.01)以及HGB含量(p<0.01)均有顯著降低(表2)。

表2 輻射對小鼠白細胞計數、紅細胞計數、血小板計數及血紅蛋白含量的影響Tab.2 Effects of radiation on WBC,RBC,PLT and HGB content in mice

2.4 電離輻射對小鼠脾臟H2AX蛋白表達的影響

圖2為照后小鼠免疫組化及Western Blotting實驗檢測結果。如圖2所示，與對照組相比，出生21天小鼠，經5 Gy照射后，通過免疫組化及Western Blotting實驗檢測均顯示脾臟H2AX蛋白磷酸化表達顯著降低(p<0.05，p<0.01)。

A：免疫組化檢測phospho-H2AX表達(×100)；B：光密度分析phospho-H2AX表達；C：Western Blotting檢測phospho-H2AX表達；D：灰度分析phospho-H2AX表達。*與對照組相比，p<0.05;**與對照組相比，p<0.01。n=7。C為對照組，IR為照射組。圖2 輻射對小鼠脾臟H2AX磷酸化蛋白表達的影響Fig.2 Effect of radiation on the expression of H2AX phosphorylated protein in mouse spleen

3 討論

5 Gy的輻射劑量對嚙齒動物的影響相當于對人類為1.67 Gy或為輕度輻射(輻射對人類和嚙齒類動物的影響系數為3.0)[10]。目前對脾臟造成影響的輻射劑量集中在3～10 Gy[5-6,11]，本研究暴露劑量屬于常見范圍。

嚙齒類動物脾臟在出生后1～4周沒有明顯的血管結構，14天左右才逐漸發揮免疫作用，3月齡前生長快速，發育成熟之后雖可繼續生長，但變化不明顯[12]。因此，發育期脾臟經歷了較長時間的生長，逐步形成組織和功能，特別容易受到不良因素的損傷。本研究采用剛斷乳小鼠(21天)為研究對象，其脾臟還處于生長成熟階段，觀察X射線輻射對其影響。結果發現，小鼠的體重、脾重及脾臟大小顯著降低，脾指數未見明顯改變。此結果與Miao等[13]實驗中小鼠的體重改變一致，但眾多成年動物暴露類似劑量中脾臟指數均降低[14-16]。分析可能由于幼年期處于動物生長發育關鍵期，對不良外源環境尤為敏感，因此輻射暴露不僅僅表現為小鼠脾臟發育，還抑制小鼠整體發育。

脾臟生長發育及其功能正常與否直接影響動物機體免疫功能和造血能力，此前研究發現成年小鼠受到輻射后會使造血功能受到較大損害，在照射后7天，小鼠的血小板、白細胞及紅細胞下降至最低點，此后機體的造血功能開始恢復[17]。在本研究中各類血細胞含量均降低，與該研究結果一致。其主要機制推測可能與氧化應激[18]和促進脾臟細胞凋亡有關[19]。

輻射致損傷的主要靶點為DSB，H2AX磷酸化是DSB的早期反應，可導致受損部位的結構改變，其關鍵作用是保留修復部位，從而啟動DNA修復機制[20]。因此，H2AX磷酸化修飾改變不僅可以用于體現DNA損傷的水平，還可以用于評估DNA修復能力的變化。有研究表明H2AX缺乏癥會增加未修復的DSB和易位的數量[21]。Urbain等人的研究也證實H2AX缺乏將導致小鼠出現氧化還原功能受損[22]。當DNA損傷無法及時修復時，機體就會啟動凋亡程序。Yang等人研究發現，輻射可以促進骨肉瘤細胞H2AX的表達，而miR-328-3p可以抑制輻射誘導的H2AX的表達并促進細胞凋亡，敲除H2AX后，2 Gy照射增加肉瘤細胞的凋亡[23]。本實驗發現電離輻射暴露可降低21日齡小鼠脾臟H2AX磷酸化的表達，進而影響小鼠脾臟生長及其造血功能，推測，其機制可能為輻射降低H2AX磷酸化蛋白表達，抑制輻射對DNA損傷修復，從而激活凋亡相關通路，隨后促進凋亡。

綜上所述，本研究發現H2AX介導了電離輻射對斷乳期小鼠脾臟發育及造血功能的抑制，其機制可能通過抑制H2AX磷酸化表達，進而影響脾臟DNA的修復能力有關。然而，本研究并未直接證實脾臟細胞DNA修復能力受損，且未比較成年與幼年小鼠H2AX影響的不同，其深層次的機制還有待進一步研究。