水質(zhì)改良滅菌劑D7對四種對蝦致病菌的作用

高佳朋 郭冉 于志文 何立彬 夏輝 朱昱錚

摘 要：為研究水質(zhì)改良滅菌劑D7對常見對蝦致病菌的抑制及殺滅效果，通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)及生態(tài)毒理學(xué)方法研究D7對哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）等4種常見對蝦致病菌的抑制效果、最佳作用時間及不同溫度對D7殺菌作用的影響。結(jié)果顯示，在35 ℃條件下，哈維氏弧菌對D7高度敏感，溶藻弧菌、副溶血弧菌對D7中度敏感，無乳鏈球菌對D7低度敏感;D7對4種菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為50.00 mg/L;D7對副溶血弧菌的最佳作用時間為4 h，對哈維氏弧菌、溶藻弧菌、無乳鏈球菌的最佳作用時間為8 h;在18、28、35 ℃條件下，D7對4種對蝦致病菌的殺滅效果無顯著差異（P>0.05）?？梢娫诒驹囼?yàn)條件下，D7對4種常見對蝦致病菌具有一定的殺滅抑制效果，最佳作用時間為8 h，且殺菌效果不隨溫度的改變而變化。

關(guān)鍵詞：水質(zhì)改良滅菌劑;D7;對蝦;致病菌;抑菌作用

D7是一款新型的高效消毒液，由美國專業(yè)消毒劑生產(chǎn)商Decon7 Systems與美國國家級實(shí)驗(yàn)室桑迪亞合作研制。研究表明D7對部分有毒有害化學(xué)品有中和、抑制效果，對病毒、部分細(xì)菌有抑制及殺滅效果[1]。此前D7廣泛應(yīng)用于食品車間消毒、畜牧車間消毒等，但并未在水產(chǎn)相關(guān)領(lǐng)域使用。D7殺菌的主要有效作用成分包含過氧化氫，過氧化氫是一種化學(xué)性質(zhì)極為活潑的強(qiáng)氧化劑，在環(huán)境中容易分解為氧氣和水，殘留較小，對環(huán)境影響較小，是一種較為清潔的消毒劑。近年來的研究表明，過氧化氫可與其他成分如季銨鹽、金屬離子、表面活性劑、無機(jī)碘化物、等離子體等產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用，與單獨(dú)過氧化氫為殺菌成分的殺菌劑相比效果更佳[2-4]。

近年來，伴隨對蝦養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)大，其面臨的環(huán)境問題也日益突出，養(yǎng)殖規(guī)模快速增長，水體富營養(yǎng)化加劇，致使養(yǎng)殖水體中有害藻菌滋生，有害細(xì)菌引發(fā)的對蝦細(xì)菌性疾病更是成為導(dǎo)致養(yǎng)殖失敗的主要病害之一[5]。在對蝦養(yǎng)殖中常見的對蝦弧菌病、腸炎病、爛鰓病、肝胰腺壞死病等疫病均是由細(xì)菌滋生感染導(dǎo)致的，而在眾多的致病菌中，又以弧菌、鏈球菌、愛德華氏菌等幾類病菌最為常見和難以根治[6]。

本研究以哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、無乳鏈球菌等4種常見的對蝦致病菌為研究對象，探究水質(zhì)改良劑D7對水產(chǎn)養(yǎng)殖有害病菌的抑制及殺滅效果，提供水質(zhì)改良劑D7在水產(chǎn)相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用的數(shù)據(jù)支撐，為今后水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用水質(zhì)改良劑D7購自D7生物科技有限公司，由美國專業(yè)消毒劑生產(chǎn)商Decon7 Systems制造生產(chǎn)。D7產(chǎn)品有效成分包括：第一部分（以下稱為“P1”）烷基二甲基芐基氯化銨和表面活性劑的混合物、第二部分（以下稱為“P2”）過氧化氫（濃度7.98%）和第三部分（以下稱為“P3”）催化劑/增效劑。

試驗(yàn)所用菌種哈維氏弧菌（Vibrio harveyi，MCCC1A13958）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，MCCC1A07296）由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供;副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，ATCC17802）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，ATCC17802）由ATCC菌種保藏中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 D7原液及使用液的配制 配置D7原液時先將D7試劑的P2、P3充分混勻，靜置反應(yīng)5 min后，加入P1，使用玻璃棒緩慢攪拌均勻，避免快速攪拌產(chǎn)生大量泡沫，配好后的D7原液可常溫保存8 h有效，需現(xiàn)用現(xiàn)配。原液配制好后可按所需比例稀釋得到D7使用液，本試驗(yàn)中加1 mL D7原液至1 L蒸餾水中，制成D7使用液。

1.2.2 培養(yǎng)基及中和劑的配制 根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[7]，哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌采用TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng);無乳鏈球菌采用血瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)。菌液擴(kuò)培菌使用LB培養(yǎng)基。

TCBS培養(yǎng)基配制時，將TCBS培養(yǎng)基粉劑加熱溶化，補(bǔ)水到所需的總體積。按照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行配制、分裝、滅菌操作。滅菌完成后，將培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時倒入平板當(dāng)中，待平板凝固后，放置于冰箱中待用[9]。

LB培養(yǎng)基配制時，按照培養(yǎng)基的配方比例在1 L的蒸餾水中加入10 g蛋白胨、10 g氯化鈉、5 g酵母膏、3 g磷酸氫二鉀、2 g蔗糖，調(diào)整培養(yǎng)基pH值為7。配制好后的培養(yǎng)基分裝滅菌步驟與TCBS培養(yǎng)基相同。

血瓊脂平板購自北京路橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，主要成分為蛋白胨、淀粉、氯化鈉、牛羊血、瓊脂等原料。

中和劑使用PBS中和劑，由2 g/L硫代硫酸鈉+3 g/L卵磷脂+10 g/L氯化鈉+20 g/L吐溫80組成。

1.2.3 菌種培養(yǎng) 因購買的菌種為菌種平板，首先對4種菌種進(jìn)行二次擴(kuò)培，取副溶血弧菌敏感菌株，在TCBS培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)12 h得到單菌落。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后[10]，以LB液體培養(yǎng)基代替3%氯化鈉蛋白胨水，接種環(huán)挑取單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基上，在37 ℃，200 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 h，制備菌液后，用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法[11]測定出相應(yīng)細(xì)菌濃度，以便計(jì)算后續(xù)NaCl添加量;取5 mL菌液于離心管中，5 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀中加入5 mL 0.85% NaCl，使細(xì)菌懸浮，重復(fù)上述離心懸浮操作2次，得到最終菌懸液。將上述菌懸液與0.5的麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比對，用0.85% NaCl進(jìn)行濃度調(diào)整得到麥?zhǔn)蠞舛?.5的NaCl菌液，吸出該菌液1 400 μL，倒入210 mL LB培養(yǎng)基中，用于最小抑菌濃度（MIC）測定、最小殺菌濃度（MBC）的測定和抑菌圈試驗(yàn)。

1.2.4 抑菌圈試驗(yàn)

1.2.4.1 稀釋菌液 取搖菌管，用移液槍吸取10 mL LB液體培養(yǎng)基，加哈維氏弧菌菌液100 μL，至搖菌管中，搖勻。副溶血弧菌、無乳鏈球菌、溶藻弧菌均同上處理。

1.2.4.2 制作含藥紙片 取出若干滅菌好的紙片，用移液槍吸取D7原液10 μL至紙片上，晾干備用。

1.2.4.3 涂板 取100 μL稀釋好的菌液于TCBS瓊脂板（無乳鏈球菌為血瓊脂平板），用涂布棒涂勻。

1.2.4.4 貼放紙片 將含藥紙片有藥液的一面貼放于涂滿菌的瓊脂板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h，取出觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，分別記為1#-3#。

1.2.4.5 抑菌效果評定 水質(zhì)改良劑D7抑菌效果評定標(biāo)準(zhǔn)為：若抑菌圈直徑大于20 mm，為高度敏感;若抑菌圈直徑在10～20 mm，為中度敏感;若抑菌圈直徑小于10 mm，為低度敏感。

1.2.5 最小抑菌濃度試驗(yàn) 取13支滅菌后的試管并依次編號（1-13號），將準(zhǔn)備好的LB液體培養(yǎng)基逐個加入試管中，1號試管加8 mL，其余每支試管加入5 mL培養(yǎng)基。1號試管加入配制好的D7使用液2 mL，混勻;從1號管取5 mL混合液加入2號管，搖勻;如此依次倍比稀釋至11號管;最后從11號試管吸取5 mL棄去。此時1—12號管D7濃度分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0 mg/L，12號管為不含D7的生長對照。所有試管中加入中和劑5 mL，1—12號管中分別加入菌液2 mL，13號試管中加入2 mL? LB培養(yǎng)基并混勻，1-11號管以T1-T11表示，12號管為對照組，13號管為空白組。以37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)18～24 h，肉眼觀察菌體生長情況，溶液最后變澄清的為最小抑菌濃度。

1.2.6 最小殺菌濃度試驗(yàn) 按照上述的D7最小抑菌濃度為基礎(chǔ)，重復(fù)上述試驗(yàn)步驟，稀釋后以對照組為基準(zhǔn)調(diào)零，測定菌液吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)菌濃度。以肉眼觀察最為澄清且OD值接近于0的為最小殺菌濃度[12]。按照上述步驟測定1—12號管后，分別取12支管菌液在無菌的TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種（無乳鏈球菌接種于無菌的血瓊脂平板），以37 ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h，以平板上無菌體生長的D7濃度值標(biāo)定為最小殺菌濃度，以對比驗(yàn)證之前的最小殺菌濃度結(jié)果。培養(yǎng)試驗(yàn)分別重復(fù)3次。

1.2.7 D7的抑菌最佳作用時間 以上述步驟得出的最小殺菌濃度進(jìn)行4種對蝦致病菌的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。首先將3種弧菌在TCBS培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，無乳鏈球菌在血瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)12 h得到單菌落，將配制好的LB培養(yǎng)基200 mL分別倒入4個錐形瓶中，挑取單菌在錐形瓶中培養(yǎng)，在37 ℃，200 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 h，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法[13]，測定菌濃度達(dá)2.0×106 CFU/mL以上;培養(yǎng)完成后分別加入最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的水質(zhì)改良滅菌劑D7，測定1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)菌濃度。

1.2.8 D7在不同溫度下的抑菌效果試驗(yàn) 參考不同養(yǎng)殖對象的適宜溫度，探究不同溫度下，D7對主要致病菌的殺滅效果。選取北方常見養(yǎng)殖對象大菱鲆、凡納濱對蝦的最適生長溫度（18 ℃、28 ℃）以及4種致病菌的最適生長溫度（35 ℃）進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)步驟參照1.2.7試驗(yàn)，最后測定8 h的吸光度（OD值）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用IBM SPSS Statistics 26分析軟件，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素方差分析（P<0.05）顯著性差異時，再采用Duncans進(jìn)行多重比較分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 D7對4種對蝦致病菌抑制作用的對比

在細(xì)菌培養(yǎng)的最適溫度35 ℃條件下，D7原液對四種對蝦致病菌有不同程度的抑制作用，見表1。其中，哈維氏弧菌對D7高度敏感，溶藻弧菌、副溶血弧菌對D7中度敏感，無乳鏈球菌對D7低度敏感。

2.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的確定

根據(jù)最小抑菌濃度試驗(yàn)顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中D7濃度達(dá)到50.00 mg/L時，4種對蝦致病菌的生長均明顯受到抑制;由表2可知，在35 ℃條件下，四種對蝦致病菌的濃度均在第4組后無顯著變化，且與對照組無顯著差異，即D7對哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、無乳鏈球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為50.00 mg/L。

2.3 D7的抑菌最佳作用時間

50.00 mg/L濃度D7對4種對蝦致病菌的有效作用時間見表3，副溶血弧菌濃度4 h后無顯著變化，故D7對副溶血弧菌的最佳作用時間為4 h;哈維氏弧菌、溶藻弧菌、無乳鏈球菌三種菌的濃度在8 h后無顯著性變化，所以D7對這3種菌的最佳作用時間為8 h。綜上所述，在使用D7（50.00 mg/L）8 h后對所有試驗(yàn)菌均有顯著性作用，所以D7對4種對蝦致病菌的最佳作用時間為8 h。

2.4 D7在不同溫度下的抑菌效果試驗(yàn)

在3種不同溫度下，D7（50.00 mg/L）對四種對蝦致病菌的抑菌效果無顯著性差異。見表4。

3 討論

通過試驗(yàn)結(jié)果可知：在35 ℃條件下，哈維氏弧菌對D7的敏感程度為高度敏感;溶藻弧菌、副溶血弧菌對D7的敏感程度為中度敏感;無乳鏈球菌對D7的敏感程度為低度敏感。劉志軒等[14]、姚剛等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，弧菌相較于其他對蝦致病菌對廣譜性殺菌劑的耐受程度較弱，這或許與這幾種弧菌的適應(yīng)機(jī)制和存活策略存在差異而導(dǎo)致藥物的有效性不同相關(guān)，其中的相關(guān)作用原理還有待今后的進(jìn)一步研究。而無乳鏈球菌對D7的敏感程度較低，這可能與無乳鏈球菌的耐藥性較強(qiáng)有關(guān)。細(xì)菌生物膜指的是存在于細(xì)菌表面，使細(xì)菌可以依附于其他物質(zhì)或者使細(xì)菌之間可以相互粘連的特殊細(xì)菌結(jié)構(gòu)[16]，細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)中含有藻酸鹽多糖，能夠保護(hù)細(xì)菌不受其他理化因子的影響，有研究表明細(xì)菌生物被膜與細(xì)菌耐藥性存在密切的聯(lián)系，細(xì)菌的耐藥性和免疫逃逸性均與該生物結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。丁浩[18]研究發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌對藥物敏感度較低，可能與無乳鏈球菌生物被膜有關(guān)。相關(guān)研究也表明，近年來由于水產(chǎn)行業(yè)抗生素類藥物的濫用，使無乳鏈球菌的耐藥性逐漸上升[19-20]。梁靜真等[21]研究指出，無乳鏈球菌對紅霉素和四環(huán)素仍較為敏感，但對硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶已產(chǎn)生了耐藥性，因此，使用非抗生素類藥物殺滅無乳鏈球菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響具有長遠(yuǎn)意義。

D7對哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、無乳鏈球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為50.00 mg/L;D7對副溶血弧菌的最佳作用時間為4 h，D7對哈維氏弧菌、溶藻弧菌、無乳鏈球菌的最佳作用時間為8 h。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)綜合考慮養(yǎng)殖水體中有害菌殺滅程度最大化及時間成本。在本試驗(yàn)條件下，水質(zhì)改良滅菌劑D7對4種常見對蝦致病菌具有一定的殺滅抑制效果，最佳作用時間為8 h;在正常養(yǎng)殖環(huán)境溫度下，不同溫度對D7滅菌效果無顯著影響。D7的殺菌有效成分有過氧化氫、苯扎氯銨等，兩成分間具有一定的協(xié)同作用。李子霞等[22]研究了過氧化氫分別與戊二醛、聚六亞甲基雙胍、苯扎溴銨組成的復(fù)方消毒劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的作用，結(jié)果顯示，三組混合殺菌劑在20 min內(nèi)對試驗(yàn)對象具有良好的殺滅效果，與單方過氧化氫的殺菌效果相比較，明顯較優(yōu)。蔡慧玲等[23]研究表明，以過氧化氫、苯扎氯銨和起泡劑三元包裝的混合即用型消毒液，其原液作用20 min對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、溶藻弧菌和脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型疫苗株的殺滅效果均符合規(guī)范的消毒要求，這些研究與本試驗(yàn)得到的結(jié)果相一致，表明D7因主要成分間的協(xié)同作用而有較好的殺菌效果。

通過對水質(zhì)改良滅菌劑D7的殺菌效果的研究表明，該水質(zhì)改良滅菌劑在較低濃度下可快速殺滅細(xì)菌繁殖體等，使用方便，性能穩(wěn)定，配方符合環(huán)保要求，且便于儲存和運(yùn)輸，具有一定的發(fā)展前景。目前水質(zhì)改良滅菌劑D7在對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中的具體使用場景和方法，還有待進(jìn)一步探索和研究。

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The effect of water quality improvement sterilizing agent D7 on four pathogenic bacteria of shrimp

GAO Jiapeng，GUO Ran，YU Zhiwen，HE Libin，XIA Hui，ZHU Yuzheng

（Marine College，Hebei Agricultural University，Qinhuangdao，Hebei 066003）

Abstract：In order to study the inhibitory and killing effects of water quality improvement sterilizing agent D7 on common pathogenic bacteria of shrimp， the inhibitory effect of D7 on the 4 common shrimp pathogens Vibrio harveyi，Vibrio parahaemolyticus，Vibrio alginolyticus and Streptococcus agalactiae， the best action time and the bactericidal effect of D7 under different temperature were studied through inhibition zone experiment and ecotoxicology method. The results showed that at 35 ℃， Vibrio harveyi was highly sensitive to D7， Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus were moderately sensitive to D7， and Streptococcus agalactiae was low sensitive to D7. The minimum inhibitory concentration and the minimum bactericidal concentration to the 4 species of bacteria were all 50.00 mg/L.The best effect time of D7 on Vibrio parahaemolyticus was 4 h， and the best effect time on Vibrio harveyi， Vibrio alginolyticus and Streptococcus agalactiae was 8 h.There was no significant difference of killing effects of D7 to the 4 species of bacteria under the temperature of 18， 28， and 35 ℃（P>0.05）. It can be concluded that under the conditions of this experiment， D7 had a certain killing and inhibitory effect on the 4 common shrimp pathogens， the best action time was 8 h， and the sterilization effect did not change with the change of temperature.

Key words：water quality improvement sterilizing agent; D7;shrimp; pathogenic bacteria; antibacterial effect

（收稿日期：2021-08-20;修回日期：2021-10-12）