肺癌骨轉移機制的研究進展

洪方正，胡若愚，薛濤

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009; 2.東南大學附屬中大醫院 心胸外科， 江蘇 南京 210009)

腫瘤轉移是癌細胞從原發灶向遠端器官擴散的過程，是造成癌癥患者死亡的主要原因之一。在肺癌、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤中，骨是第三大常見的轉移灶[1]。約70%的轉移性前列腺癌和乳腺癌患者伴有骨轉移，約30%的轉移性肺癌患者伴有骨轉移[2]。就骨轉移發生部位而言，大多數腫瘤主要轉移到中軸骨，特別是脊柱(87%)、骨盆(63%)和肋骨(77%)[3]。 基于病變的特征性影像學表現和成骨/破骨細胞的主導地位，骨轉移可分為溶骨性骨轉移和成骨性骨轉移。當破骨細胞介導的骨吸收占主導地位時，如肺癌或多發性骨髓瘤，骨轉移的病理表現以局灶性骨破壞等溶解性病變為主。相反，在以成骨細胞活性增加為特征的骨轉移中，如前列腺癌，則表現為成骨性骨轉移的骨硬化病變。鑒于肺癌骨轉移主要表現為溶骨性病變，本文重點放在溶骨性骨轉移機制的闡述上。

1 骨轉移機制

1.1 腫瘤轉移的一般特性

腫瘤轉移是一個多環節的復雜過程，從腫瘤最開始發生到最終形成遠處轉移灶的每一個步驟都有其獨特的調控機制。

轉移的發生是以腫瘤細胞從原發腫瘤處逃逸并進入循環而開始的。在這一環節中，腫瘤細胞的上皮-間質轉化(EMT)在其中扮演重要角色。細胞的EMT是細胞失去其上皮特征并獲得間質特征的過程，如細胞間黏附蛋白的喪失和上皮極性的喪失[4]；腫瘤細胞還可以通過分泌蛋白水解酶如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)溶解細胞外基質，協助腫瘤細胞逃離腫瘤基質進入循環[5]，成為循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)。

根據Paget[6]的“種子和土壤”癌癥轉移假說，腫瘤轉移的形成不僅需要具備轉移能力的腫瘤細胞“種子”，也需要適合發生轉移的腫瘤細胞生長的“土壤”。腫瘤細胞若要在特定器官中定植，首先必須要營造一個適合其生存的環境。因此，轉移前龕位(pre-metastatic niches，PMN)的概念應運而生。原發腫瘤分泌的細胞因子、腫瘤動員的骨髓來源細胞(bone-marrow-derived cells，BMDCs)和預轉移部位基質微環境是PMN形成的三大要素[7]。腫瘤細胞在轉移之前，原發腫瘤會通過選擇性地釋放多種細胞因子或細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的方式主動修飾PMN，使其有利于隨后轉移到該龕位上的腫瘤細胞的生存和生長。而形成后的PMN也會通過誘導趨化的方式引導獲得轉移能力的CTCs向其趨化，并最終形成腫瘤轉移灶。

一般來說，在骨轉移的病變類型中分為溶骨性病變和成骨性病變。成骨性病變在肺癌中并不常見。 當腫瘤開始發生骨轉移時，有轉移能力的腫瘤細胞被募集到骨骼上的PMN后，刺激破骨細胞的活化，抑制骨保護素(osteoprotegerin，OPG)和成骨細胞的活性而增加骨質的吸收，造成骨溶解性的病變。骨基質溶解后釋放出的生長因子又會反過來作用于腫瘤細胞促進其增殖，最終形成骨骼破壞的“惡性循環”。

1.2 肺癌骨轉移

肺癌骨轉移是晚期肺癌患者的常見并發癥，其發生率高達30%～40%；60%的肺癌首診時已發生骨轉移[8]。近年來，雖然在肺癌骨轉移的早期診斷和治療上取得了可喜的成績，但骨轉移的預后仍然不容樂觀。在丹麥的一項研究中，沒有骨骼相關事件的骨轉移患者的1年生存率為12.1%，而發生骨骼轉移和骨骼相關事件的患者的1年生存率僅為1%[9]。所以，了解肺癌骨轉移的具體機制并將其應用到臨床當中去是當下的迫切需求。

1.2.1 EMT和肺癌骨轉移 并非所有類型的腫瘤都易于發生骨轉移，骨轉移更多地發生在某些特定的腫瘤中；同時，在所有明確發生腫瘤細胞播散的病例中，似乎都會在骨髓中發現少量殘留的腫瘤細胞[10]。有趣的是，在這些腫瘤中，大多數病例在其病程中并未觀察到骨轉移的相關病理及影像學證據。上述現象提示，原發腫瘤和腫瘤微環境可能是決定該腫瘤是否會發生骨轉移的關鍵因素。

大量研究已經證明，EMT過程與腫瘤細胞的干性、遷移、轉移及耐藥等特性相關。異常的Wnt/β-catenin通路激活會誘導腫瘤EMT的發生及發展。在肺癌中，β-catenin會在缺氧環境中過表達，進而促進腫瘤細胞的遷移并誘導其形態學的改變[11]。進一步的研究[12]顯示，EMT是一個持續的過程，而非兩極化的狀態改變，癌細胞通常處于完全上皮化和完全間質化表型之間的一種中間形態，分子表型則表現為上皮和間充質標志物的共表達，或上皮細胞標志物喪失后不出現間充質標志物的表達。目前看來，具有高度上皮-間充質可塑性的腫瘤細胞最有可能成為轉移的起源細胞，因為它們能以(半)間充質狀態逃離原發腫瘤，逃離后再切換回其上皮特征的表型以達到在遠處轉移的目的[13]。肺癌患者的血液存在處于上皮和間質狀態之間的CTCs[14-16]，并且肺實體瘤中也存在處于上皮和間充質標志物共表達的細胞[17-18]。用單細胞測序技術在小鼠胚胎期的腸、肝、肺和皮膚的上皮細胞中發現了普遍的處于上皮/間質混合狀態的細胞，這些細胞同時高表達上皮細胞黏附分子(epcam)、整合膜蛋白(claudins)等上皮細胞的標志物，以及波形蛋白(vimentin)富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(sparc)等間質細胞標志物[19]。值得注意的是，部分EMT細胞的經典轉化因子(transition factor，TF) SNAI1/2、ZEB1/2、TWIST1/2的表達非常低，與上皮細胞基本一致。這就提示除了經典的轉化因子途徑外，還有其他影響EMT發生的機制存在。

1.2.2 PMN 在肺癌溶骨性骨轉移中，腫瘤分泌的賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)在沒有腫瘤細胞直接參與的情況下誘導了早期的溶骨性改變[20]。此外，腫瘤細胞可以通過非編碼RNA調控PMN的形成并最終達到協助腫瘤轉移的目的。miR-139-5p可以下調間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中Notch-1信號傳導并促進其向成骨細胞分化，該過程參與了肺癌細胞向骨骼部位轉移的啟動[21]。細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是近些年的研究熱點，腫瘤來源的細胞外囊泡在PMN形成中擔任的角色也被廣泛探討。Qi等[22]的研究表明,囊泡中的miR-660-5p可能通過靶向KLF9來調節肺癌的生存能力。Taverna等[23]發現,肺癌細胞分泌的含有表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)配體和雙調蛋白(amphiregulin)的EVs可以誘導小鼠破骨細胞的分化。除了基因水平的調控外，Kim等[24]還發現，囊泡上的鞘磷脂可以促進血管的生成。攜帶程序性死亡受體配體(PD-L1)的EVs到達靶器官后可以抑制免疫系統，促使PMN的形成[25]。來自原發腫瘤分泌的EVs和各種因子會促進BMDCs及其他一些免疫細胞遷移至潛在的PMN處，形成免疫抑制的微環境，為腫瘤細胞的到來做好準備[26]。其中，骨髓來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)被認為是PMN形成中不可或缺的一份子，其產生的血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)會上調E選擇蛋白(E-selectin)以促進腫瘤細胞的黏附，致使循環中的腫瘤細胞優先歸巢至該病灶并發生增殖[27]；在非小細胞肺癌的患者中，轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)刺激PMN中的MDSCs上的CD39和CD73的表達，并抑制T細胞和NK細胞的活性[28]，為腫瘤細胞的定植創造了免疫抑制的微環境。MDSCs還會分泌MMP9同時作用于VEGF的上、下游來破壞血管穩定性[29]，而血管通透性的改變和新生血管則是有利于腫瘤細胞最初定植的重要條件[30]。

目前，大量的有關PMN形成機制的研究都集中在肺內轉移上，關于骨轉移相關的研究很少。鑒于骨骼系統在理化、生化及解剖因素上的特殊性，有關肺轉移PMN的相關機制是否同樣適用于骨轉移值得進一步研究。需要明確的一點是：骨骼環境特有的物理特性(剛性的基質、高鈣水平、高度缺氧的環境)對于PMN形成和后續轉移也有很大的影響[31]，比如在脊柱骨轉移的研究中，紅骨髓豐富的部位就更容易形成轉移灶[32]。更有研究表明腫瘤細胞除了通過全身血液循環播散并最終導致骨轉移外，椎靜脈叢可能也在骨轉移中起到了重要作用。椎靜脈叢是從顱骨到骨盆延伸的無瓣靜脈網絡。在一項對290例骨轉移患者的回顧性研究中，頭頸部腫瘤患者的頸椎轉移發生率、胸部腫瘤患者的胸骨轉移的發生率、骨盆腫瘤患者的骨盆骨轉移發生率均高于對照組[33]，這與肺癌、乳腺癌及前列腺癌之間骨轉移的分布差異相互印證[34-35]，證明了血流動力學在骨骼轉移中占據了重要地位。目前，有關肺癌骨轉移仍須解決的問題包括：在軟組織轉移灶中觀察到的機制是否適用于骨骼轉移？在轉移的整個過程中，PMN到底發生了怎樣的動態變化？手術切除原發腫瘤后，PMN是否還會持續增加？

1.2.3 肺癌靶向骨轉移 肺癌靶向骨轉移的機制目前尚未得到充分的闡述。有關靶向骨轉移機制的研究多集中在乳腺癌和前列腺癌上。如基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor1，SDF-1)和其受體CXCR4在乳腺癌及前列腺癌中可以將腫瘤細胞招募至骨骼上[36]；趨化因子CXCL10可以將表達其受體CXCR3的乳腺癌細胞吸引到骨骼[37]。肺癌中的CXCR4[38]和CXCL10[39]也處于高表達狀態，這提示上述機制在肺癌中發揮類似促進骨轉移的作用亦有可能。Valencia等[40]發現,盤狀結構域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)與肺癌的較低存活率有關，抑制DDR1可以使腫瘤細胞向骨骼歸巢的早期腫瘤和骨的結合受損。同時，外泌體表面的整合素被認為與腫瘤特定部位轉移息息相關[41-42]。但值得注意的是，外泌體整合素的研究集中在肺、腦及肝轉移上；趨向骨骼的外泌體表面的整合素表達卻相當有限，雖然能一定程度上誘導血管通透性改變，但完成靶向骨轉移的過程顯然還需要其他機制的輔助[41]。

不同于其他器官，在骨轉移中血流動力學可能占據了更重要的地位。將3種腫瘤細胞系(黑色素瘤、肺癌、前列腺癌)的細胞和惰性的生物學微珠(biologically passive microbeads)分別植入小鼠脈管系統，3 h后觀察到微珠和上述3種腫瘤細胞在軟組織器官中的擴散存在顯著差異，而在脊柱中的擴散未見明顯差異，同時3種腫瘤細胞在脊柱中各部位的聚集情況也未見明顯差別[43]。惰性微珠不受細胞因子等生物學因素調控，而更多反映血流動力學對移植物體內分布的影響，因此上述研究結果間接證明了，在骨轉移中血流動力學的影響是勝于細胞因子等生物學因素的更重要的主導因素。這個發現也與腫瘤細胞總是更容易在靠近原發部位的椎體中定植的現象相呼應[34]。

1.2.4 肺癌骨轉移的溶骨性病變 產生溶骨性轉移的前提是破骨細胞的活化。肺癌細胞會分泌含有EGFR結合雙調蛋白(EGFR binds amphiregulin，AREG)的外泌體誘導破骨細胞中的EGFR信號異常激活，繼而上調MMP9，觸發溶骨性轉移[23]。來自肺腺癌的含有miR-21的外泌體也可以抑制程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)以促進破骨細胞生成。此外，癌細胞獲得骨細胞的基因型和表型特性的現象稱之為Osteomimicry。關于該現象的研究目前大多集中在前列腺癌和乳腺癌中[44]。Koeneman等[45]認為,腫瘤必須表達骨細胞相應的基因型或表型才能完成骨轉移。利用生物信息學方法可證明高表達編碼成骨細胞相關蛋白的肺癌細胞具有更差的預后和更晚的分期[46]。當然，有關其在肺癌中的具體作用還需要更多的實驗去證明。腫瘤細胞會釋放各種細胞因子以促進溶骨作用的發生，如甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)[47]和Notch配體Jagged1。在肺腺癌中，miR-153可以靶向Jagged1來調節癌細胞的生長和轉移[48]。PTHrP作用于成骨細胞以增加NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)的分泌同時抑制OPG的分泌。靶向PTHrP的miRNA-33a可以減少NSCLC中的骨吸收[49]。在一項對1 149名高鈣血癥性肺癌患者循環中PTHrP水平的回顧性研究[50]中發現，PTHrP>150 pmol·L-1的患者中位生存期縮短(1.4個月vs.5.4個月),同時骨轉移發生率升高(71.4%vs.12.5%)[50]。RANKL會與破骨細胞前體相互作用，導致其活化并最終成為成熟的破骨細胞。同時，成骨細胞還會合成OPG與RNAKL競爭性結合RANK從而抑制破骨細胞的功能[51]。因此，破骨細胞的活化及RANKL與OPG直接相關。RANKL在非小細胞肺癌細胞誘導溶骨活性的過程中是必不可少的，抑制RANKL通路不僅可以在肺癌小鼠模型中抑制腫瘤生長[52]，也減少了破骨細胞的生成并減緩轉移的進程[53]。Huang等[54]發現,廣泛溶骨現象的發生會釋放骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)、TGF-β等進入骨基質，BMP2與成骨細胞及NSCLC細胞協同促進巨噬細胞向破骨細胞分化。TGF-β在肺癌基質中的上調會促進腫瘤的進展和侵襲[55]，同時導致溶骨因子PTHrP表達和分泌增加[56]，最終形成了骨轉移中的“惡性循環”。

2 肺癌骨轉移的診斷和治療

2.1 診斷

目前由于影像學技術的進步，肺癌骨轉移的檢出率已大大提高。CT/MRI中骨質破壞的表現、ECT中的核素濃聚以及PET/CT中代謝值的變化都可以被視為骨骼變化的良好標志。骨代謝的生物化學標志物，如堿性磷酸酶等的變化也提示骨轉移發生的可能。但確診骨轉移的發生仍然是基于病理學的最終證據。

2.2 治療

除了傳統的放化療和手術治療之外，針對骨轉移的治療方法還有骨改良藥物、分子靶向治療和免疫治療等。

2.2.1 骨改良藥物 如雙磷酸鹽可以抑制破骨細胞活性，誘導破骨細胞凋亡，減少腫瘤引起的溶骨性病變。地諾單抗能夠特異性靶向RANKL，從而抑制破骨細胞活化和發展，減少骨的吸收，增加骨密度。

2.2.2 分子靶向藥物 如EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)，其第一代的吉非替尼、厄洛替尼，第二代的阿法替尼以及第三代的奧西替尼，對于EGFR基因突變的非小細胞肺癌患者的治療頗有成效[57-58]。且與單獨化療相比，以EGFR-TKI作為一線治療的肺癌骨轉移患者似乎有更好的預后[8,59]。或是以間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因為靶點的酪氨酸酶抑制劑,其第一代的克唑替尼,第二代的色瑞替尼、艾樂替尼等,對肺癌骨轉移患者的預后均有正面效果[60-61]。

2.2.3 以VEGF為靶點的治療 抗血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)的單克隆抗體貝伐珠單抗聯合含鉑雙藥化療藥物,是目前晚期非鱗非小細胞肺癌的標準一線治療方案之一[58]。同時貝伐珠單抗與化療聯合治療肺癌骨轉移可以延長骨轉移進展時間，并且降低相關不良事件的發生[62]。

2.2.4 針對免疫檢查點的藥物 主要有程序性死亡受體-1(programmed death1，PD-1)及其配體(PD-L1)的抑制劑。單獨或與化學療法聯合使用的PD-1/PD-L1抑制劑可顯著改善總生存期，而聯合化療可使無進展生存期延長[63]。

2.2.5 其他 NSCLC中的單胺氧化酶A(monoaminoxidase A，MAOA)的高表達與EMT及NSCLC臨床病理特征的發展有關，MAOA抑制劑G11可通過影響VEGF、HIF1α和MMP2或MMP9來抑制耐紫杉醇的NSCLC轉移及生長[64]。該發現提供了以MAOA為靶標的聯合治療藥物的可行性。

血小板反應蛋白(thrombospondin-2，TSP-2)通過RANKL途徑促進破骨細胞生成，并改變成骨細胞分化過程中RANKL/OPG的比例。TSP-2基因敲除可在體內抑制肺癌的溶骨轉移，因此其可能成為將來治療肺癌骨轉移的靶標[65]。

3 展 望

晚期肺癌骨轉移不僅影響患者的生活質量，而且增加了患者的經濟負擔及心理壓力。目前大量關于骨轉移的研究集中在乳腺癌和前列腺癌上，缺乏對調控肺癌骨轉移這一過程的分子機制的報道。了解導致肺癌骨轉移的機制對于探索更有效的治療方法是非常重要的，這也體現了精準醫學理念下對肺癌的精準治療。同時大量研究聚焦于晚期患者，缺乏早期患者的相關數據，不利于轉移的早發現、早治療。因此，為更好地防止肺癌骨轉移。我們認為未來的研究方向主要集中在：(1) 開發更高靈敏度和特異度的骨轉移檢查手段，如更精準的影像學手段或生物標志物;(2) 建立更可靠的肺癌骨轉移發生的預測模型，對高風險人群進行更加嚴密的監控和預防，實現“早發現”“早治療”的目的;(3) 基于肺癌骨轉移的特有的機制研發新一代的藥物;(4) 聯合放射、核醫學，設計放射性同位素粒子，進行內放射治療。

此外，骨骼特有的特殊的理化性質及與骨髓的特殊解剖關系使肺癌骨轉移機制與一般器官可能有所不同，在其他器官上觀察到的有關轉移的機制是否適用于骨骼轉移仍有疑問。仍需更多有關肺癌骨轉移的的研究來進一步闡述其相關機制，以更好地為后續治療提供理論支撐。