高效液相色譜法測定食品接觸材料及制品中9種酚類物質的遷移量

劉桂華，蘇 鳳，李 威，寇海娟*，眭 潔，李曉曼，羅世鵬*

（1．常州工業及消費品檢驗有限公司，江蘇 常州 213017；2．南京海關危險貨物與包裝檢測中心，江蘇 常州 213022；3．江蘇理工學院 化學與環境工程學院，江蘇 常州 213001）

苯酚、甲酚、二甲酚等酚類物質是生產酚醛樹脂、環氧樹脂、脲醛樹脂、密胺樹脂、聚碳酸酯（PC）等基礎樹脂的工業原料。這些樹脂常用于制造餐飲具、涂層罐等食品接觸材料。苯酚、甲酚、二甲酚等物質對皮膚、粘膜有腐蝕作用，可抑制中樞神經或損害肝、腎功能。誤服或經皮膚吸收，可造成急性中毒，出現頭痛、惡心、乏力、視物模糊、肺水腫、昏迷等癥狀。以酚類物質為原料制成的食品接觸材料與食品接觸的過程中，殘留的游離酚類物質有遷移到食品中的風險，對食品安全和人體健康造成潛在危害。因此，國內外相關標準對酚類物質制定了限制性要求。經涂料生產企業調研得知，食品接觸用涂料中常用的酚類物質包括苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、2，6-二甲基苯酚、2，5-二甲基苯酚、2，3-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚。我國 GB 9685－2016[1]中允許苯酚、2，6-二甲基苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚在涂料中作為添加劑使用，其中2，6-二甲基苯酚的特定遷移限量（SML）為0．05 mg/kg，苯酚SML為3 mg/kg，鄰甲酚、間甲酚、對甲酚的SML均為60 mg/kg。除2，6-二甲基苯酚外的其他二甲酚均屬未授權的添加劑，依據我國GB 4806．1－2016標準[2]要求，對這類未授權物質的遷移量也需進行控制。歐盟No．10/2011法規及其修訂法規[3]中對酚類物質的管理要求與我國GB 9685－2016管理要求相近。

目前，酚類物質的測定方法主要有滴定法[4]、顯色法[4－5]、液相色譜法[6－10]、液相色譜－串聯質譜法[11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜－質譜法[8－9，13－14]等。滴定法、顯色法可測定酚類物質的總量，簡便易行，但無法分辨酚類物質的種類；色譜法具有分離能力，可實現各酚類物質的定性和定量分析，相關文獻報道中以檢測雙酚 A[9，14]、壬基酚[14]、2，6-二甲基苯酚[8]等酚類物質遷移量方法為主，而對苯酚、甲酚、二甲酚等9種酚類物質同時測定的研究較少。

本文以涂料行業、塑料行業普遍使用的苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、2，6-二甲基苯酚、2，5-二甲基苯酚、2，3-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚共9種酚類物質為研究對象進行方法開發和優化，以滿足我國食品安全國家標準的監管要求為導向，建立一種準確、可靠、便于推廣的檢測方法，為食品接觸材料生產企業對自身產品安全管控提供技術支持，同時為政府監管部門對涂料產品的食品安全風險監測提供技術保障。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑及標準物質冰乙酸、無水乙醇（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇（色譜純，上海泰坦科技股份有限公司）；精制橄欖油（化學純，上海泰坦科技股份有限公司）；標準物質：苯酚（Phenol，純度99．0%）、鄰甲酚（o-Cresol，98．0%）、間甲酚（m-Cresol，98．0%）、對甲酚（p-Cresol，98．0%）、2，6-二甲基苯酚（2，6-Xylenol，98．0%）、2，5-二甲基苯酚（2，5?Xylenol，99．0%）、2，3-二甲基苯酚（2，3-Xylenol，99．0%）、3，5-二甲基苯酚（3，5-Xylenol，98．0%）、3，4-二甲基苯酚（3，4-Xylenol，99．0%）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.2 實驗耗材一次性針式注射器（5 mL）、親水PTFE微孔濾膜（25 mm，0．22μm）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.3 實驗樣品從市場隨機采購15批PC塑料樣品（包括冷水壺、盎司杯、調酒器、杯子、運動水壺、巧克力模具），并從涂料生產企業征集15批涂層樣片，每個樣品平行采集2份。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技公司），配熒光檢測器；Agilent ZORBAX SB－Aq色譜柱（4．6 mm×150 mm，3．5μm，安捷倫科技公司）；XS104分析天平（梅特勒－托利多有限公司）；SIGNMA3－15離心機（北京勵行儀器有限公司）；Milli－Q Advantage純水儀（美國Millipore公司）；MVW－2500數顯型多管式渦旋混合器（上海泰坦科技股份有限公司）；SK8200HP超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合標準儲備液（1 000 mg/L）的配制分別精密稱取0．05 g（精確至0．1 mg）各酚類物質標準品于燒杯中，加入少量甲醇溶解后，轉移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3.2 水基食品模擬物中系列混合標準工作溶液的配制分別用水基食品模擬物為溶劑將混合標準儲備液逐級稀釋成0、0．10、0．20、0．40、1．0、2．0、3．0、5．0 mg/L的混合標準工作液。

其他水基食品模擬物，包括水、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、4%乙酸。

1.3.3 含油脂類食品模擬物系列混合標準工作液的配制用異丙醇為溶劑將混合標準儲備液逐級稀釋成5．0、10、20、30、40 mg/L的混合標準中間液。分別稱取5．0 g橄欖油（精確至0．01 g）至6個帶蓋的玻璃離心管，離心管中分別加入100μL系列混合標準中間液渦旋混勻，再分別加入2．0 mL 67%甲醇溶液渦旋混勻2 min，以4 000 r/min離心10 min，取下層溶液經親水PTFE微孔濾膜過濾后待測。得到系列混合標準工作溶液中酚類物質的含量分別為0．10、0．20、0．40、0．60、0．80 mg/kg。

1.3.4 遷移試驗按GB 31604．1－2015[15]和GB 5009．156－2016[16]的要求，分別采用模擬酸性食品，以水、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、4%乙酸、橄欖油為食品模擬物，對食品接觸材料及制品進行遷移實驗，遷移試驗結束后，將所得模擬物充分混勻后待處理。

1.3.5 遷移試驗所得浸泡液的處理取1～2 mL遷移試驗所得水基食品模擬物，經親水PTFE微孔濾膜過濾后待測。

準確稱取5．0 g（精確至0．01 g）遷移試驗所得橄欖油至帶蓋玻璃離心管中，加入2．0 mL 67%甲醇溶液，渦旋提取2 min后，以4 000 r/min離心10 min，取上層甲醇溶液過親水PTFE微孔濾膜后待測。

1.3.6 液相色譜條件色譜柱為Agilent ZORBAX SB－Aq色譜柱（4．6 mm×150 mm，3．5μm）；流動相：A為甲醇，B為水，梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15%A；5～25 min，15%～22%A；25～30 min，22%～30%A；30～31 min，30%～5%A；31～35 min，5%A；流速：1．0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10μL。熒光檢測器的激發波長為214 nm，發射波長為315 nm。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 液相色譜柱的選擇本研究的9種酚類物質均為強極性化合物，且結構相似，還存在部分同分異構體。通常強極性物質在C18柱上的保留較弱，不易實現各物質的有效分離，而氰基柱、改性的C18色譜柱更適合分離強極性物質。因此，本研究分別考察了Phenomenex Kinetex C18（4．6 mm×150 mm，5μm）、Phenomenex ACE Excel 3 Aq（4．6 mm ×100 mm，3μm）、Phenomenex ACE Excel 5 CN（150 mm ×4．6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB－CN（4．6 mm × 250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB－Aq（4．6 mm×150 mm，3．5μm）5種液相色譜柱的分離效果。結果表明，C18柱、氰基柱上各酚類物質的色譜峰出現重疊，尤其是二甲酚的幾種同分異構體，甚至通過改變流動相的洗脫程序，部分同分異構體的色譜峰仍無法實現基線分離，而采用Agilent ZORBAX SB－Aq（4．6 mm×150 mm，3．5μm）經過流動相洗脫程序優化后，可實現9種酚類物質的有效分離，因此本研究最終選擇Agilent ZORBAX SB－Aq色譜柱進行分離。

2.1.2 熒光檢測器檢測條件的優化通過激發波長掃描，確定9種酚類物質的最大激發波長，并分別在各物質的最大激發波長下掃描發射波長，得到各物質的最大發射波長。在各激發波長和發射波長條件下，以9種酚類物質的色譜峰形對稱性良好、峰寬較寬、響應強度較強為選擇原則，最終確定熒光檢測器的激發波長為214 nm，發射波長為315 nm。混合標準溶液的典型色譜圖如圖1所示。

圖1 9種酚類物質標準溶液的色譜圖Fig．1 Chromatogram of 9 phenols standard solution

2.2 前處理條件的優化

水基食品模擬物中9種酚類物質可直接上機檢測。橄欖油中9種酚類物質需采取液液萃取，綜合考慮9種酚類物質的溶解性及與液相色譜柱的進樣要求，采用極性溶劑進行萃取。分別準確稱取5．0 g（精確至0．01 g）精制橄欖油于3個25 mL具塞離心管中，分別加入100μL 40 mg/mL的標準儲備液（以異丙醇為溶劑），渦旋混勻后，得到加標濃度為0．40 mg/kg的標準工作液，再分別加入2．0 mL提取溶劑，渦旋提取2 min，以4 000 r/min離心10 min使兩相分層，提取液層經親水PTFE微孔濾膜過濾后，采用LC測定。各提取溶劑的提取效率見表1。

表1 橄欖油中9種酚類物質的提取效率Table 1 Extraction efficiencies of nine kinds of phenols in olive oil （%）

首先考察了水、甲醇、乙腈3種提取溶劑的提取效率。結果顯示，水提取液中3種甲酚類物質、5種二甲酚類物質的提取效率均低于20%，這是由于這8種酚類物質在水中的溶解性較苯酚差所致。甲醇、乙腈兩種提取液中除苯酚外，其他8種目標物色譜峰峰形的對稱性差，均出現前延現象，且峰形展寬導致分離度降低，從而造成定量困難，并以乙腈中此現象更為嚴重。可能原因是橄欖油中存在沒食子酸、丁香酸、咖啡酸等酚類物質對目標物質的檢測產生干擾，以及提取溶劑與初始流動相的匹配性差。

綜合分析水、甲醇、乙腈3種溶劑的提取效果，采用在甲醇中加入少量水，降低橄欖油中成分在甲醇中的溶解度，改善色譜峰形。分別考察了50%甲醇、67%甲醇對9種酚類物質的提取效率。結果顯示，67%甲醇提取液中9種酚類物質的峰形對稱，無共流出物，提取效率在80%～95%之間；50%甲醇提取液中每種目標物質的提取效率均低于67%甲醇的提取效率。因此，本研究確定采用67%甲醇溶液為提取溶劑。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量下限按本方法對各食品模擬物中9種酚類物質的系列混合標準工作液進行測定，以其中目標物質的峰面積（y）對其濃度（x）作圖，得到標準工作曲線。5種水基食品模擬物中9種酚類物質在0．10～5．0 mg/L范圍內，含油脂食品模擬物中9種酚類物質在0．10～0．80 mg/kg范圍內，其線性方程的相關系數（r2）均高于0．999，說明本方法具有良好的線性。分別以基線平均噪音的3倍和10倍對應目標物質的濃度作為方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），結果顯示，5種水基食品模擬物中9種酚類物質的檢出限為0．03～0．05 mg/L，定量下限為0．07～0．10 mg/L，含油脂食品模擬物中9種酚類物質的檢出限為0．05～0．08 mg/kg，定量下限為0．15～0．20 mg/kg，說明方法具備較高靈敏度。實驗結果如表2～3所示。

表2 水基食品模擬物中9種酚類物質的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，LODs and LOQs for 9 phenols in aqueous food simulants

（續表2）

表3 含油脂類食品模擬物中9種酚類物質的線性關系、檢出限及定量下限Table 3 Linear relations，LODs and LOQs for 9 phenols in fatty food simulants

2.3.2 回收率與相對標準偏差采用在陰性樣品浸泡液中分別添加低、中、高3個濃度的混合標準溶液驗證方法的準確度和精密度，每個加標水平制備6個平行測試樣，根據本方法進行前處理和儀器測定，計算其平均回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表4。從表4可見，在所有的加標濃度下，各食品模擬物中9種酚類物質的平均回收率為90．7%～99．8%，RSD為0．06%～5．6%，說明本方法具有良好的準確度和精密度。

表4 不同食品模擬物中9種酚類物質的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs for 9 phenols in different food simulants（n=6）

2.4 實際樣品的測試

市場隨機采購的11批PC塑料樣品，涂料生產企業征集的15批涂層樣片，按照本方法進行測定。測定結果見表5，典型樣品譜圖見圖2。PC塑料樣品遷移量檢出物質均為苯酚，且遷移量結果均符合GB 9685－2016中SML為3 mg/kg的要求。涂層樣片遷移量檢出物質有鄰甲酚、間甲酚、2，6-二甲基苯酚，其中鄰甲酚、間甲酚的遷移量均符合GB 9685－2016中SML為60 mg/kg的要求，而2，6-二甲基苯酚的遷移量均超出了GB 9685－2016中SML為0．05 mg/kg的要求。所有樣品均未檢出其他二甲基苯酚類物質的遷移量，可能由于該類物質屬于未授權使用的物質，因此涂料生產企業在配方設計時對該類物質的使用量較低，以保證這些二甲基苯酚類物質不會遷移到食品或食品模擬物中。

圖2 典型樣品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of typical samples

表5 PC制品和涂層樣品中9種酚類物質遷移量的檢測結果Table 5 Detection results of 9 phenols migration from PC articles and coatings

（續表5）

3 結 論

本研究采用高效液相色譜建立了食品接觸用PC制品及酚醛樹脂涂層制品中9種酚類物質遷移量的檢測方法。經方法驗證及實際樣品檢測證實，本方法前處理操作簡便易行，分析儀器在全國范圍普及率高，且各項技術參數均滿足定量方法相關的標準要求，可作為現行食品安全國家標準中對酚類物質遷移量管控要求的配套檢測方法，在全國各地的食品接觸材料檢測領域內推廣使用。同時，本方法可為檢測機構和相關監管部門對食品接觸材料及制品中酚類物質的合規性評價及風險評估提供技術支持。