PINK1/Parkin信號通路調控線粒體自噬在敵草快中毒神經元損傷中作用的研究進展

吳瑾，陸元蘭，張爐英，胡杰，岑祥瑩，喻安永，謝智慧

(遵義醫科大學附屬醫院 1.急診科，2.重癥醫學科，3.高壓氧科，貴州 遵義 563003)

敵草快(Diquat，DQ)作為一種速效的非選擇性雙吡啶類除草劑，其結構與百草枯(Paraquat，PQ)相似。隨著國內PQ水劑停產，DQ作為農業或家庭除草劑在市場上的銷售量劇增，同時關于DQ中毒的病例報道也越來越多[1]。據研究，DQ的潛在毒性主要與它可以通過氧化還原產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，導致氧化應激致細胞死亡有關。急性DQ中毒時會造成機體多臟器損傷，如消化系統、心血管系統、腎臟和神經系統損傷等[2]。目前急性DQ中毒的治療措施主要以減少毒物接觸與吸收、清除氧自由基、抗炎等為主[3]；而對于DQ導致神經損傷的治療仍無明顯有效方案，DQ的神經毒性損傷機制也不清楚。線粒體是動態的雙膜細胞器，通過氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為機體提供活動所需能量；線粒體自噬是特異性清除受損線粒體的自噬現象，維持著線粒體的質量控制(quantity control，QC)[4]。PTEN誘導的假定激酶1(PINK1)及Parkin蛋白組成自噬通路，是線粒體自噬的關鍵調節蛋白[5]；當機體發生急性DQ中毒時，體內驟變的氧化應激環境使線粒體膜電位發生改變，此時Parkin蛋白則被激活并招募至受損線粒體外膜上參與介導受損線粒體的自噬[6]；而PINK1作為感知受損線粒體膜電位變化的重要分子探測器，作用于Parkin蛋白的上游并調控著Parkin蛋白的轉位活動。研究發現，線粒體自噬可以保護仔豬腸道細胞免受DQ誘導的氧化應激下的細胞死亡，促進了腸道內的穩態[7]，可見PINK1/Parkin信號通路調控的線粒體自噬在維持細胞正常功能方面發揮重要作用。因此探討PINK1/Parkin信號通路調控的線粒體自噬在DQ神經元損傷機制中的作用是很有意義的。作者就PINK1/Parkin信號通路調控線粒體自噬與DQ神經元損傷的關系作一綜述，期望對DQ神經毒性有一新的認識，為DQ神經損傷治療提供新思路。

1 PINK1/Parkin信號通路調控線粒體自噬在神經系統疾病中的研究進展

PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是目前已知的唯一具有線粒體靶向結構域的蛋白激酶[8]。健康細胞中PINK1水平較低，其由含有外膜轉位酶40(outer membrane transposase 40，TOM40)和外膜轉位酶20(outer membrane transposase20，TOM20)核心的復合物導入線粒體，并被線粒體加工肽(mitochondrial processing peptidase，MPP)和線粒體菱形蛋白酶PARL(PINK1/PGAM5-associated rhomboid like protease)等線粒體蛋白酶依次切割，而裂解后的PINK1通過N端規則途徑在細胞質中被迅速降解[9]。人類Parkin蛋白是由PARK2基因編碼的具有E3泛素-蛋白連接酶活性的蛋白，主要介導底物泛素化，調節蛋白降解和信號轉導等。Parkin蛋白在生理狀態下處于抑制狀態，當其N-端泛素樣(ubiquitin-like，Ubl)結構域上絲氨酸 65(Serine65，S65)位點發生磷酸化后活性被激活[10]。當線粒體失去內膜電化學梯度即發生線粒體去極化時，PINK1向線粒體的導入被抑制，PINK1蛋白穩定在線粒體外膜上，此時線粒體上PINK1激酶活性的積累觸發了Parkin蛋白的招募和激活[9]。發生活化的Parkin蛋白會促進許多外線粒體膜(outer mitochondrial membrane，OMM)蛋白的泛素化和降解，進而介導受損線粒體的自噬清除[11]。有研究顯示，體內線粒體電子傳遞鏈破壞后產生過多有害活性氧(ROS)，顯著誘導線粒體損傷[12]，并且這種有害效應隨后可能在整個線粒體網絡中傳播，最終導致神經元死亡[13]。自噬是一種高度調控和保守的溶酶體介導的蛋白降解和細胞器循環過程。線粒體自噬通過清除可能成為細胞凋亡信號的受損線粒體促進細胞存活[14]。最初支持Parkin蛋白參與調節線粒體功能的研究是在果蠅中進行的，研究發現，當缺乏Parkin蛋白時果蠅線粒體出現各種異常表現，如線粒體腫脹、嵴紊亂、對毒物敏感性升高、壽命縮短和運動缺陷[15-16]。小鼠細胞缺乏Parkin蛋白時，線粒體的移動和運輸可通過微管的過度乙酰化而被抑制[17]；敲除Parkin蛋白的小鼠線粒體形態和線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)水平發生改變，進而導致了多巴胺(Dopamine，DA)神經元的退化和運動障礙[18-19]。Nemes等[20]發現，在阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)神經元內的高磷酸化的微管相關蛋白tau聚集物，即神經纖維纏結(nerve fiber tangles，NFTs)中，Parkin是γ-谷氨酰鍵交聯的主要成分，首次提示Parkin與AD之間存在關系；而Corsetti等[21]的研究表明AD個體中N末端微管結合蛋白tau的截斷通過異常招募Parkin蛋白引起線粒體自噬失調，最終導致線粒體過度翻轉、突觸退化和神經元死亡的結果，進一步提供了在AD發病機制中的Parkin蛋白的相關機制；Fiesel等[22]研究表明，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者的大腦中存在線粒體自噬的依據。不僅如此，Lan等[23]在雄性大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷中的研究中也觀察到大腦皮層缺血半暗帶神經元、星形膠質細胞和血管內皮細胞超微結構變化及線粒體自噬現象。由此可以看出PINK1/Parkin信號通路及其調控的線體自噬在神經系統疾病中的重要性。

2 PINK1/Parkin信號通路調控線粒體自噬與DQ中毒后神經元損傷的相關性

2.1 核因子-kB(NF-kB)/P53信號通路在DQ中毒神經元損傷中的作用

DQ為吡啶類除草劑，具有強氧化性。研究發現當PC12神經細胞暴露于DQ溶液時，DQ可抑制線粒體復合物Ⅰ活性，產生過多的ROS促使細胞色素C釋放至胞質，活化半胱天冬酶-3(caspase 3)表達介導PC12神經細胞死亡，在該過程中上調的ROS導致鈣離子失調，破壞線粒體膜電位，導致線粒體功能障礙[24]；NF-kB是一種普遍存在于胞質中的異二聚體，非刺激狀態下以無活性狀態存在[25]。氧化應激下ROS可促進蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活，活化的PKC磷酸化抑制蛋白IkB[26]，導致IkB與NF-kB解離而使NF-kB活化；NF-kB可進一步調控炎癥過程，在促凋亡因子P53的啟動序列中，NF-kB可以通過NF-kB位點直接調控促凋亡因子P53的表達，最終使PC12神經細胞中的NF-kB和P53表達增強，沉積于細胞質和細胞核中[24]。促凋亡因子P53在正常生理狀態下可通過細胞色素C氧化酶2(cytochrome C oxidase 2，SCO2)的反式激活維持線粒體正常呼吸，但在應激狀態時，ROS的生成增多促進P53誘導mieap誘導線粒體內溶酶體樣細胞器(mieap-induced accumulation of lysosome-like organelles within mitochondria，MALM)的積累以修復功能不全線粒體，mieap誘導空泡(mieap-induced vacuole，MIV)完成受損的線粒體降解；當應激或損傷不可逆時，P53則會易位進入線粒體外膜，導致線粒體促凋亡基因Bax和Bak的釋放。Bax和Bak分別可以形成線粒體通透性過渡孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)導致細胞色素C的釋放，進一步加重線粒體功能障礙，最終可導致PC12神經細胞凋亡[27]；當PC12神經細胞經抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)預處理后，再次暴露于DQ溶液時，NAC抑制NF-kB信號及P53的表達，減輕了PC12神經細胞的凋亡[28]。以上研究說明在DQ中毒后，NF-kB與P53因子協同激活保守的線粒體死亡途徑(包括Bax激活、細胞色素C釋放和半胱天冬酶的激活)[24]，促進神經元死亡。

2.2 Parkin蛋白與NF-kB/P53信號通路在DQ中毒神經元損傷中的作用

DQ中毒后通過氧化還原抑制線粒體呼吸復合物Ⅰ的活性，引起線粒體膜電位改變[29]，進一步造成線粒體外膜上具有線粒體靶向結構域的蛋白激酶PINK1積累，觸發了Parkin蛋白的招募和激活[9]，活化的Parkin蛋白則促進線粒體外膜蛋白的泛素化和降解[30-31]，最終導致受損線粒體的自噬清除。研究發現，在人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中，Parkin蛋白對應激狀態下的細胞有保護作用。細胞發生應激時，Parkin增加了NF-kB基本調節器(NF-kB essential modulator，NEMO)的線性泛素化，上調NF-kB信號轉導表達；而NF-kB進一步上調人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中位于線粒體膜間隙的視神經萎縮1(optic atrophy 1，OPA1)的表達，進而維護線粒體完整性和保護應激誘導的細胞死亡，其中OPA1是線粒體嵴完整性的關鍵調控因子，可以調控細胞色素C的釋放。另外，研究也發現Parkin蛋白可以通過NEMO誘導OPA1的表達和加工過程，阻止細胞色素C的釋放[32],NEMO是IkB激酶的核心調控因子[33]。Henn等[34]發現,在NF-kB信號通路中，IkB的超阻遏物過表達時Parkin蛋白便不能再刺激NF-kB的轉錄；在IkB激酶信號小體水平，非活性的IKKβ突變體阻斷了NF-kB信號通路的激活，說明Parkin蛋白可能作用在IKK復合物和(或)其上游成分，其神經保護作用也依賴于IKB激酶/NF-kB信號通路的激活。Sha等[35]研究發現，PINK1作用在Parkin蛋白的上游，也參與了IkB激酶/NF-kB信號通路增強Parkin蛋白介導的泛素信號參與的神經保護作用。此外，也有研究表明促凋亡因子P53的表達可被Parkin蛋白抑制[36]，說明在發生DQ中毒時，Parkin蛋白不僅可以通過調控線粒體自噬也可通過上調NF-kB表達及抑制P53因子表達發揮神經保護功能。

2.3 PINK1蛋白與NF-kB/P53信號通路在DQ中毒神經元損傷中的作用

Lim等[37]研究發現,在PINK1蛋白導入線粒體時，全長PINK1被一系列線粒體蛋白酶逐步修飾為53 kDa的裂解形態(PINK1-53)，PINK1-53不抑制Parkin介導的線粒體自噬，相反，它似乎觸發Parkin轉位到正常線粒體，促進線粒體自噬，引起自身的清除；在沒有異位全長PINK1參與的情況下，通過進一步檢測不被降解的PINK1截斷突變體PINK1△104的表達發現，PINK1△104被腫瘤壞死因子受體相關蛋白6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)泛素化，TARF6是PINK1穩定的調節因子，也是NF-kB通路的傳感器，說明NF-kB通路激活穩定了PINK1-53的表達，間接地穩定了線粒體自噬。而當DQ中毒時，NF-kB功能激活，P53基因表達上調。Goiran等[38]研究發現，P53基因通過抑制PINK1啟動子活性及其蛋白和mRNA表達水平來控制其表達，揭示PINK1是第一個被P53轉錄抑制的促自噬基因，Parkin蛋白抑制P53基因的表達，他們通過實驗進一步證實了P53對PINK1的調控與Parkin無關，同時發現Parkin也可以在PINK1上游作用，以調節其轉錄和促自噬功能。

3 PINK1/Parkin信號通路調控線粒體自噬在DQ中毒神經元損傷中的治療展望

PINK1/Parkin信號通路介導受損線粒體的自噬清除對于維持神經元正常功能是至關重要的，增強PINK1/Parkin信號通路介導的線粒體自噬可減輕神經元損傷。Lin等[39]研究表明,鼠草尾酸(carnosic acid，CA)通過激活PINK1/Parkin/線粒體自噬途徑，可以保護SH-SY5Y細胞免受6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導的線粒體損傷。具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞的紅景天苷(Sal)通過增強PINK1和Parkin蛋白在線粒體上的表達，顯著增加了線粒體自噬和自噬通量，在MPP+/MPTP誘導的PD模型中，Sal可能通過增強PINK1/Parkin蛋白介導的線粒體自噬而發揮神經保護作用[40]。順鉑是一種鉑基化療藥物，暴露于順鉑下可誘導PC12神經細胞ROS生成增多，細胞線粒體膜電位下降，細胞ATP減少，顯著降低神經元的長度和核直徑，引起周圍神經病變(peripheral neuropathy,CIPN)；通過建立體外順鉑誘導的神經毒性模型研究，表明PINK1/Parkin/線粒體自噬對順鉑誘導的PC12神經細胞線粒體功能障礙具有保護作用，Parkin蛋白過表達時顯著增加了神經元的長度和核直徑[41]。且最新研究發現白藜蘆醇可增強腸線粒體中PINK1和Parkin水平，改善DQ所致的線粒體腫脹、空泡化和嵴破裂；而當白藜蘆醇含量降低時ROS生成量增多、線粒體膜電位改變、空腸線粒體DNA含量及線粒體復合物Ⅰ-Ⅳ活性增加，表明在仔豬DQ中毒時，白藜蘆醇在保護腸道屏障、改善氧化還原狀態、減輕線粒體損傷和誘導線粒體自噬方面具有顯著作用[42]。有研究[43-44]發現，三丁醇在DQ中毒的豬仔中可增加腸道線粒體自噬蛋白(PINK1和Parkin蛋白)的表達，降低了氧化應激和腸道炎癥，誘導了線粒體自噬，改善線粒體功能，進而減輕神經功能障礙。因此在發生DQ中毒后，早期及時維持或增強PINK1及Parkin蛋白的表達對于神經細胞的保護是相當有意義的。

綜上所述，神經保護蛋白PINK1/Parkin與DQ中毒神經元損傷之間通過NF-kB/P53信號通路以及線粒體自噬相互聯系，DQ中毒后給予藥物干預可以通過增加線粒體自噬蛋白PINK1和Parkin的表達改善線粒體功能，減輕神經元損傷。因此，臨床上發生急性DQ中毒時，維持PINK1和Parkin蛋白表達，加強PINK1/Parkins信號通路調控的線粒體自噬將會是減輕DQ中毒神經元損傷的工作重點，也是我們的努力方向，期望能進一步明確DQ中毒神經損傷的機制，為DQ中毒神經損傷的治療提供合理的理論依據。