缺氧誘導因子-1/2在肝細胞癌中的研究進展

郭海鑫，胡唯偉，楊勇，陳真

(中國藥科大學，江蘇 南京 210009)

肝癌(liver cancer)是2018年全球第六大癌癥和第四大癌癥死因，其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占到原發性肝癌的75%～85%[1]。2019年1月國家癌癥中心公布了2015中國癌癥數據，數據顯示，惡性腫瘤已經成為我國國內居民首要的死亡原因，其中，肝癌的發病率高居第四位，其死亡率更是僅次于肺癌，居第二[2]。包括肝細胞癌在內的實體瘤的發生發展除了受腫瘤細胞自身的內在因素控制外，腫瘤細胞所處的生長環境也會對腫瘤產生重要的影響[3]。

自1955年，Thomlinson等通過對肺癌患者癌巢組織的研究后，第一次提出腫瘤缺氧的概念以來，經過近70年的臨床病理分析及實驗室體內外研究的證實，腫瘤細胞生長在一種高度缺氧的環境內，并且這種現象是廣泛存在于各種實體瘤中。缺氧作為腫瘤微環境的一種特征，腫瘤細胞通過啟動一系列轉錄因子，不僅使腫瘤適應了低氧的生長環境，還能參與到腫瘤的增殖凋亡、侵襲轉移、表型的決定、血管生成、能量代謝和腫瘤耐藥、放化療抵抗以及病人的預后程度等進程中。在這一系列的轉錄因子中缺氧誘導因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是一種調控與氧相關的核心轉錄激活因子。腫瘤細胞在缺氧條件下通過缺氧誘導因子激活下游眾多信號通路，促進了腫瘤細胞的惡性程度[4-5]。本文主要聚焦在目前研究熱度相對比較高的缺氧誘導因子家族中的HIF-1α和HIF-2α，綜述了HIF-1α和HIF-2α在肝細胞癌發生發展過程的作用及臨床現狀。

1 缺氧誘導因子(HIFs)概述

1.1 HIFs的結構和分類 HIFs是一個異二聚體結構蛋白，屬于PAS(Per/Amt/Sim)結構域家族。它由兩個均具有螺旋-環-螺旋(basic-helix-loop-helix，bHLH)結構的氧敏感型的α亞基和氧不敏感型的β亞基組成[6-7]。目前，已發現的缺氧誘導因子家族有3個亞型，分別是HIF-1、HIF-2、HIF-3，三者均是由α亞基和β亞基組成[8]。現有研究主要集中在發現比較早且生物活性相對明確的HIF-1α和HIF-2α中，對HIF-3α研究相對較少。

在HIFs蛋白3個不同亞型的α亞基中均含有氧依賴降解區(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)，這是對氧敏感的關鍵區域，也是蛋白結構中唯一能夠感知氧氣濃度變化的亞單位，不僅決定著HIF蛋白的穩定性，同時也決定了蛋白的生物活性。在HIF-1α和HIF-2α中，分別在N端和C端均具有一個反式轉錄活化結構域(transactivation domains，TAD)[9]。二者在N端的反式轉錄活化結構域(N-TAD)的不同，直接導致特異性的調節不同靶基因，同時N-TAD與ODDD存在重疊，因此在調節蛋白穩定以及維持生物活性方面起著重要的作用。C端的反式轉錄活化結構域(C-TAD)能夠與p300/CBP結合后共同啟動缺氧條件下的轉錄。

β亞基屬于結構性亞基，其中發現最早的研究最多的是HIF-1β亞基。HIF-1β又稱芳香烴核轉位子(aryl hydrocarbon receptor translocator，ARNT)。其蛋白表達不受氧影響，能夠持續性的表達。因為HIF-1α和HIF-2α在蛋白結構和序列上存在高度相似，所以二者都能夠與HIF-1β形成不同的異二聚體。

1.2 HIFs的氧調節機制 HIFs蛋白的生理功能主要由氧敏感型的α亞基調控，因此在眾多對HIFs的研究中，主要是針對具有生物活性的HIF-α亞基。同樣，HIFs蛋白的凋亡一般也是指發揮主要生物活性的由氧調控的HIF-α亞基的凋亡。含氧(或常氧)時，在脯氨酰羥化酶(prolylhydroxylases，PHD)的作用下，N-TAD區域的ODDD區域的脯氨酸殘基被羥化。羥化后的脯氨酸殘基能夠被腫瘤抑制蛋白pVHL(von Hippel-Lindau protein)識別捕獲，pVHL能夠被E3泛素連接酶配體所識別，組成泛素連接酶復合物，從而介導HIF-α亞基進入泛素蛋白酶體途徑降解。缺氧(或低氧)時，PHD表達量減少，使得HIF-α亞基的ODDD區域脯氨酸殘基羥化水平降低，減少了與pVHL的結合，泛素化降解途徑受到抑制，從而使得HIF-α亞基表達量上升。HIF-β亞基在結構上不含ODDD結構域， 因此HIF-1β亞基的表達不受氧氣含量的影響，在常氧或缺氧時均能夠穩定表達。在缺氧時，HIF-1α或HIF-2α易位至細胞核內，與HIF-1β在核內結合形成異二聚體后，與p300/CBP進一步結合形成具有轉錄活性的HIF轉錄復合物，啟動相應靶基因的轉錄調控[10-11]。

有研究發現，在缺氧條件下，腫瘤中首先出現顯著上調的是HIF-1α，其表達峰值出現在缺氧后4 h。當長時間缺氧后，HIF-1α的表達量下降，同時HIF-2α表達量上升[12]。同時，由此可見，HIF-1α與HIF-2α存在著一定的反饋機制。急性缺氧條件下，以HIF-1α表達為主，在長時間的慢性缺氧條件下是以HIF-2α表達為主[4]。

1.3 缺氧誘導因子的靶基因 HIF-1α和HIF-2α在結構和序列上有著高度的相似性，并且都具有結合靶點基因啟動子中的缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)，因此二者在下游調控上存在著一些共同的靶基因，如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、 白細胞介素-6(IL-6)、葡萄糖載體蛋白-1(GLUT-1)、腎上腺髓質素(ADM)、脂肪細胞分化相關蛋白 (ADPR)等[13]。但因二者在缺氧條件下存在著一定的負反饋調節機制，表達量有所差異，以及結構序列上的差異，所以它們的所介導的共同的靶基因調節模式有所不同。也因此，二者存在著一些各自特異性的靶基因。如胰島素樣生長因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)、內皮素-1(ET-1)、血小板源性生長因子(PDGF)、血紅素氧合酶-1(HO-1)、誘導型NO合酶(iNOS)等均是 HIF-1α的特異性靶基因。細胞周期蛋白(cyclin D1)、轉化生長因子-α(TGF-α)、VEGF受體-2(Flk-1)、干性轉錄因子Oct-4等則是受到HIF-2α調控的特異性調控的靶基因。這些共有的和特異性的靶基因均是腫瘤在惡性發展過程中的關鍵性靶點。

2 缺氧誘導因子與肝細胞癌

肝細胞癌主要是由肝硬化引起，其由包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)，酒精性脂肪肝(ALD)和病毒性肝炎在內的慢性肝病發展而來，這些慢性肝病中大部分都存在組織缺氧的特征[14]。目前HCC的治療選擇非常有限，加上HCC患者確診時大部分都已經是晚期，只有少數HCC早期階段的患者可以通過肝切除或移植等手術治療手段治愈。但是，其中近一半左右的患者在切除后會發生腫瘤的復發和轉移。同時，臨床上HCC晚期的患者對化療存在很強的抵抗。

缺氧條件下腫瘤內的HIF-1α和HIF-2α的轉錄和活化導致了下游大量的基因的表達被上調。大部分基因所編碼的蛋白參與到了腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉移、代謝、血管生成，同時也影響了腫瘤的耐藥性。

2.1 缺氧誘導因子調控肝細胞癌機制 臨床病理及目前已有報道，在HCC組織中HIF-1α癌巢的表達水平均高于癌旁組織，但對于HIF-2α的表達與癌巢組織的關系仍然存在爭議[15-16]。另外，HIF-1α或HIF-2α的高表達水平與較差的腫瘤分級、靜脈血管浸潤、肝內轉移和包膜浸潤有關。同時，因為二者的高表達也與無病期短和較低的生存率相關，所以HIF-1α和/或HIF-2α也可作為HCC不良預后的檢測標志物。 此外，也有臨床報道，HIF-1α的遺傳變異與HCC發生和預后也存在相關，也可因此將其作為檢測的生物標志物。這些臨床結果提示HIFs在HCC發生和發展中發揮著重要作用。

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HCV)陽性的HCC患者中，HIF-1α的表達量要顯著高于高于陰性HCC患者，同時HBV中的HBx蛋白表達量與HIF-1α表達也呈現正相關[17]。除此以外，HIF-1α通過介導生長因子，如血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，轉化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)和胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)等促進腫瘤細胞的增殖以及血管新生。同時這些細胞因子的與它們相應酪氨酸激酶受體結合后也會通過PI3K/AKT或Ras/Raf/MEK/ERK信號通路在缺氧條件下促進HIF-1α的生成，形成反饋機制，加速腫瘤惡化。除了生長因子外，也有研究報道腎上腺素受體β2(ADRB2)蛋白以AKT依賴形式穩定HIF-1α蛋白促進HCC的增殖[18]。另外，熱休克蛋白HSP90通過調節HIF-1a表達也能夠促進HCC的增殖并且抑制細胞凋亡[19]。雖然HIF-2α轉錄的靶基因有促進細胞增殖的周期蛋白，但是目前對于HIF-2α在HCC增殖方面的作用仍然存在爭議。有研究報道，HIF-2α能夠通過E2F1信號途徑抑制HCC的增殖，促進HCC凋亡[20]。

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腫瘤的轉移是許多HCC患者發生不良預后的主要原因，而上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞發生轉移的必要條件。HIF-1α和HIF-2α能夠直接下調E-鈣黏蛋白(E-cadherin)促進腫瘤細胞向間充質細胞轉化，以獲得轉移能力[21-22]。同時，HIFs也能通過誘導諸如Snail、Twist-1、Twist-2等E-Cadherin抑制因子來促使腫瘤細胞加快EMT進程[22-23]。有研究報道，在持續性缺氧狀態下的HCC細胞的壞死碎片可以誘導M2型巨噬細胞釋放IL-1β，IL-1β通過與環氧酶-2結合，上調HIF-1α，從而促進HCC細胞的EMT進程[24]。最新的研究發現，HCC中HIF-2a能夠被lncRNA NEAT1激活從而在慢性缺氧條件下促進EMT[25]。

除了腫瘤細胞通過自身發生EMT外，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是影響腫瘤細胞發生轉移的另一關鍵因素。MMPs能夠降解腫瘤細胞的組織學屏障胞外基質(extracellular matrix，ECM)，從而使腫瘤細胞脫離原發病灶，進入循環系統，加速腫瘤的轉移。其中，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中降解ECM最主要的成員。已有報道，HCC缺氧條件下確實MMP-2高表達[26]，并通過siRNA技術沉默HIF-1α基因后能夠顯著的減少MMP-2和MMP-9的蛋白表達[27]，由此可見缺氧條件下HIF-1α能參與調控MMP-2和MMP-9，促進腫瘤的形成轉移灶。

HCC細胞是一種高代謝的腫瘤細胞，對葡萄糖的消耗要高于一般的正常細胞。這種高代謝特征則是通過糖酵解的方式來維持。甚至在富氧條件下，腫瘤細胞通過進行有氧糖酵解來更加快速地獲取更多的ATP，即腫瘤細胞的瓦氏效應(Warburg effect)。HIF-1α通過特異性的轉錄激活一系列與糖酵解相關的靶基因，例如葡萄糖轉運蛋白GLUT-1、GLUT-3以及糖酵解酶GAPDH、HK1、HK2、PFKL、PGK1、PKM2、ALDOA、ENO1和 LDHA等，極大地提高糖酵解效率，促進了瓦氏效應[28]。在缺氧條件下，腫瘤細胞會發生無氧糖酵解，即巴斯德效應(Pasteur effect)。已有文獻報道HIF-1a是巴斯德效應中核心轉錄因子，在缺少HIF-1a的前提下，腫瘤細胞無法在缺氧環境中完成無氧糖酵解以滿足高代謝所需的ATP，從而使腫瘤細胞凋亡[29]。

2.2 缺氧誘導因子促進肝細胞癌耐藥 目前，多激酶抑制劑索拉菲尼(Sorafenib)和樂伐替尼(Lenvatinib)是僅有的兩個FDA批準的用于治療晚期HCC的一線化療藥物，但它們對改善HCC晚期患者整個生存期的作用也很有局限。因此，在目前并無更多更好的化療藥物供患者選擇的前提下，為了更好的利用有限的治療藥物，了解它們在HCC中的耐藥機制尤為重要。

Sorafenib是一種多靶點激酶抑制劑，可以通過靶向抑制酪氨酸激酶受體如VEGFR和PDGFR等抑制腫瘤血管生成，同時也能夠抑制胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶而抑制腫瘤細胞的增殖。但臨床中，一方面，由于原發性耐藥的原因，HCC晚期患者中只有少數患者對Sorafenib響應。另一方面，在對Sorafenib響應的患者中，Sorafenib僅能延長患者3個月左右的生存期，之后就會因獲得性耐藥對其產生抵抗。

Sorafenib通過阻斷HIF-1α/VEGF途徑減少腫瘤血管生成，造成HCC的供養和供氧不足，以此阻止HCC細胞增殖和遷移侵襲[30]。雖然一定程度上通過“饑餓”手段殺傷了腫瘤細胞，但長此以往，使得更耐缺氧和饑餓的HCC細胞存活下來，大大的降低了Sorafenib后期的治療效果[31-32]。P-糖蛋白在化藥抵抗中扮演著重要的角色，它與化療藥物結合后形成的復合物會被細胞外排，有研究直接敲低HIF-1α后發現可降低P-糖蛋白的表達[33]，提高Sorafenib的利用效率。ADRB2也能夠通過HIF-1α調節糖酵解方式使HCC或者Sorafenib的抵抗性[18]。除此以外，缺氧還能誘導Yes相關蛋白(Yes associated protein，YAP)的核轉位，增強HCC細胞的干性和抗凋亡能力使其存活下來。由于HIF-1α和HIF-2α之間存在相互調控的關系，Sorafenib對HIF-1α/VEGF的抑制，會促使HIF-2α的表達增加，激活TGF-α/EGFR途徑，以此補償Sorafenib通過HIF-1α/VEGF通路對HCC的殺傷作用[34]。另有研究報道，COX-2/PGE2軸能夠調節HIF-2α，降低HCC對Sorafenib的抵抗[35]。另外，還有研究報道HIF-2α還能夠直接轉錄調控多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)相關基因MDR-1、MRP-1及LRP[36]。這些耐藥基因除了能夠加速化療藥物的外排，降低化療藥物的治療效果外，還與腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生理功能相關。Lenvatinib是在2018年才被批準用作治療HCC晚期患者一線治療藥物，因此目前對Lenvatinib的HCC耐藥研究機制研究相對較少。

2.3 缺氧誘導因子與肝細胞癌治療 HIFs能夠以直接或間接的方式參與到HCC的發生發展以及耐藥過程中，因此，靶向抑制HIFs聯合現有一線藥物的治療會是HCC治療的一個新的突破口，有望因此改善晚期HCC患者生活質量，延長生存期。

BAY87-2243是拜耳公司(Bayer)開發的一種通過特異性抑制HIF-1α和HIF-2α累積的HIFs抑制劑。2011年Bayer啟動了BAY87-2243的臨床試驗(NCT01297530)，但在2013年，BAY87-2243的臨床試驗被Bayer主動終止。在肝細胞癌治療方面，有研究通過組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑與BAY87-2243聯用，能有更加有效的抑制HCC遷移侵襲[37]。

拓撲替康(Topotecan)是HIF-1α特異性抑制劑，能夠阻止HIF-1信使RNA的翻譯。目前已經完成了用于HCC的治療的I期臨床試驗[38]。

PT2385是HIF-2α特異性抑制劑，可通過抑制HIF-2α、增加AR和抑制STAT3、Akt和ERK途徑下游的激活而提高Sorafenib治療效果[39]。

另外，姜黃素衍生物EF24，是一類非典型的HIF-1α抑制劑，通過抑制細胞分裂，誘導凋亡等其本身就具有一定的抑癌作用，是一個潛在癌癥治療藥物。Sorafenib與EF24聯用，EF24在缺氧條件下通過介導pVHL與HIF-1α的結合，促進HCC細胞中HIF-1α的以pVHL以來的方式通過E3泛素化途徑降解以達到抑制HIF-1α的作用，降低HIF-1α的表達所帶來的對Sorafenib的耐藥[31]。

鑒于HIF-1α和HIF-2α之間的反饋調節機制以及二者均參與到其耐藥過程中，更多的研究者開始意識到，在臨床上應當選取能夠同時靶向HIF-1α和HIF-2α的抑制劑，才能更加相對有效的解決由缺氧引起的耐藥問題。

2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol，2ME2)是無生物活性的雌二醇通過兒茶酚氧位甲基轉移酶(COMT)體內代謝的產物。它能夠通過抑制HIF-α亞基蛋白合成、核易位及轉錄活性的方式抑制HIF-1α和HIF-2α，且人體耐受性極好。這些優勢使得2ME2在抗腫瘤作用中表現出極高的價值。目前，2ME2用于治療腫瘤已經進入Ⅱ期臨床試驗階段，雖然效果并不理想，但是由于其良好的耐受性，2ME2的研究主要是集中在化療領域。有文獻報道，在缺氧條件下2ME2聯合Sorafenib 用于HCC細胞的體外實驗中，聯合使用下能抑制HCC細胞增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，極大提高了Sorafenib的藥效[40]。

YC-1是HIF-2α/HIF-1α抑制劑。YC-1在對HIFs的抑制上，蛋白水平顯著降低，而mRNA卻并無變化，這說明YC-1是通過轉錄水平來抑制HIFs[41]。

除了小分子抑制劑外，基因技術的不斷發展，siRNA、shRNA這種更加精準的基因靶向技術也進入臨床中用于治療癌癥。通過siRNA或shRNA直接沉默HIFs基因，使其不表達或低表達。另外一種基因治療手段則是反義寡核酸技術，通過反義DNA或反義RNA去識別靶基因的mRNA，干擾靶基因的蛋白翻譯[42]。

3 展望

HCC患者往往在早期的時候被忽略而錯過最佳治療，被發現確診的時候大部分患者都已經入晚期，可供選擇的有效治療藥物品種少更是使得其晚期患者的治療和生存期大打折扣。缺氧是包括肝癌在內的所有實體瘤的共性，HIFs及其所調控的下游基因的激活在HCC進程中發揮著舉足輕重的作用。研究者們也開始越來越多的關注到缺氧對HCC的影響，并以此篩選了眾多的HIFs抑制劑化合物，但離真正應用到臨床還相差甚遠。一方面是HCC患者用藥的巨大需求以及現有治療藥物太少且療效有限的窘迫局面，另一方面是HIFs在HCC進程中發揮著巨大作用，是HCC患者治療的希望。HIFs作為一個新靶點，HCC治療的新策略，新思路，對其作用機制仍需要不斷深入挖掘。