健康人血液中人乳頭瘤病毒DNA檢測及定量分析

劉宏錢， 宋朝暉， 梁巧米

（浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院，浙江 杭州 310006）

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌的重要致病因子[1]。目前，已經發現的HPV亞型有200多種[2]，其中14種與生殖道癌高度相關，被稱為高危型HPV[3]。全球范圍內70%的宮頸癌是由HPV 16型和HPV 18型導致的[4]。另外，HPV感染也與口咽癌、生殖器疣和皮膚疣等密切相關；HPV可感染上皮細胞，其復制周期與宿主細胞分化密切相關[5-7]。高危型HPV感染宮頸上皮細胞時，病毒通過子宮內膜和外子宮頸之間的單層鱗狀細胞到達目標上皮細胞[8]。多項對于有高度病變癥狀的患者的研究結果表明，HPV DNA廣泛存在于生殖道感染患者、宮頸癌患者、口咽鱗狀細胞癌患者、頭頸部癌癥患者和肛門鱗狀細胞癌患者血液中[9-13]。此外，也有HPV DNA在人類免疫缺陷病毒感染的兒童外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中被檢出的報道[14]。這些發現均提示，在癌癥患者的血細胞中檢測到的HPV可能來源于病變晚期的轉移細胞，或PBMC釋放。健康和無癥狀感染者PBMC中也能檢測到HPV DNA。CHEN等[15]在8.3%的澳大利亞獻血者的血液中檢出HPV DNA，提示PBMC可能是HPV的一個儲存庫和一個潛在的新的傳播途徑。然而，這些初步結果并沒有被新的研究證實。因此，對于HPV DNA在健康獻血者PBMC中是否存在，仍需要更加廣泛的研究。本研究旨在通過對獻血人群的PBMC進行HPV DNA定量檢測和評估，為血液作為HPV傳播途徑的可能性提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采集2019年10—12月杭州市第一人民醫院血液中心207名健康獻血者的血液，獻血者中男94名、女113名，年齡18～60歲。所有獻血者人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和梅毒螺旋體血清學篩查結果均為陰性。

1.2 試劑與儀器

LightCycler480熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），DNeasy Blood & Tissue Kit（德國Qiagen公司），10×SYBR Green qPCR buffer（美國伯樂公司），Taq酶、dNTPs[寶生物（大連）工程有限公司]。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA抽提

取1 mL全血放入含1 mL 0.9%氯化鈉溶液的潔凈玻璃管中，混勻，吸取混勻液，沿管壁緩慢加入到含0.5 mL Ficoll溶液的潔凈玻璃管中。2 300×g離心20 min，吸取中間層白色細胞（單核個細胞）于1.5 mL離心管中，13 800×g離心5 min，棄上清液，提取沉淀中的DNA，嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作。

1.4 HPV-DNA定量檢測

采用LightCycler480熒光定量PCR儀進行HPV DNA定量檢測，采用通用引物GP5+/GP6+擴增HPV L1基因約150 bp的片段，同時擴增內參基因β-globin上長度為268 bp的片段，內參基因擴增引物參照文獻[16-18]進行設計。PCR體系為50 μL，包括10×SYBR Green qPCR 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2），1.5 U Taq DNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTPs，正、反向引物各0.06 μmol/L，2 μL DNA模板。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，循環40次；72 ℃延伸10 min。每個樣本均同時做HPV和內參基因平行檢測。

標準曲線用10倍梯度稀釋的、攜帶完整HPV-16基因的SiHa細胞（分別包含1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101病毒拷貝）。病毒載量計算公式為：log（拷貝數）=-0.277 6×Ct+11.005；r2=0.997 3。該方法的靈敏度為1×101病毒拷貝。HPV病毒載量以每毫升血液中病毒拷貝數表示。

1.5 HPV-L1基因的擴增和測序

使用通用引物GP5+（5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3'）和GP6+（5'-GAAAATAAACTGTAAATCATTC-3'）擴增HPV-L1基因140～150 bp特異性片段。在反應體系為25 μL的Go-Taq Master mix（Promega）中進行。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72℃延伸10 min。擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。將測序結果與美國國立生物技術信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸數據庫進行Blast比對。

2 結果

2.1 獻血者流行病學特征

207名健康獻血者均未報告明顯或無癥狀的HPV感染。有14名（6.8%）獻血者HPV DNA定量檢測陽性，其中男5名、女9名，年齡（38.7±12.4）歲。

2.2 HPV DNA檢測及分型結果

用GP5+/GP6+引物從陽性樣本HPV L1基因中擴增出140～150 bp的基因組區域，對擴增的特異性片段進行Sanger測序，測序結果與NCBI核酸數據庫進行比對。結果顯示，14例陽性樣本中有7例為單一型別HPV感染，7例為混合感染。單一感染中有3例為16型，其余分別為33型、51型、70型和82型（各1例）。多重混合感染包括5例16型和18型雙重感染，1例51型和59型混合感染，1例16型、32型、35型和66型4重感染。見表1。

表1 健康獻血者HPV DNA陽性樣本型別分布和病毒載量

2.3 HPV病毒載量檢測結果

所有陽性樣本病毒載量為12.4～39.3拷貝/mL，平均為（21.30±8.27）拷貝/mL。單一型別感染HPV病毒載量為16.8～39.3拷貝/mL；多重混合感染中HPV病毒載量為7.8～24.6拷貝/mL。見表1。

3 討論

眾所周知，上皮細胞是HPV感染的靶細胞，病毒復制與細胞分化緊密相關。此外，有研究發現，宮頸癌患者血液細胞中也存在HPV DNA[19]。PAO等[20-21]首次在52%（13/25）的泌尿生殖道感染婦女的血液樣本中檢測到多種型別的HPV DNA，在宮頸癌患者的血液中也能檢測到HPV DNA。在宮頸癌前病變、頭頸部鱗狀細胞癌和口咽癌患者的血清或血漿中都檢測到HPV DNA[22]。這些患者血液中的HPV DNA可能來源于轉移性的感染細胞，或者是HPV感染細胞存在于血液中，即HPV感染的細胞會從局部感染部位進入患者血液。

有學者發現，14%（8/57）的人類免疫缺陷病毒陽性的嬰幼兒HPV-16 DNA陽性[14]。這些患兒HPV DNA陽性不能用HPV感染的腫瘤細胞的存在來解釋。在這種情況下，HPV DNA大概率是通過輸血傳播或者母嬰傳播，提示HPV可通過血液傳播。

目前，僅有2項研究報告了健康人外周血中存在HPV DNA[14-15]。BODAGHI等[14]檢測了19名健康獻血者，其中HPV-16 DNA陽性3名，陽性率為15.8%；他們推測HPV DNA是以游離DNA的形式存在于這些獻血者血液中的。但他們研究中納入的樣本數偏少，相關結論尚需更多樣本和研究來證實。澳大利亞的1項研究結果顯示，有8.3%（15/180）的健康獻血者外周血白細胞中存在HPV DNA，其中高危型占1.7%（3/180）[15]。本研究在健康獻血者的PBMC中檢出了6.8%（14/207）的HPV DNA陽性，其中高危型占92.9%（13/14），遠高于澳大利亞的研究數據[15]。高危型所占比例的差異可能源于不同國家、不同地區HPV型別的流行性差異。

目前，關于宮頸癌患者血液中HPV病毒載量的研究比較少，有研究報道的平均值為586拷貝/mL[23]，也有研究報道的平均值為253拷貝/mL[24]，DONG等[25]在血漿樣本中檢測到的平均值為183拷貝/mL。提示HPV病毒載量作為一個潛在指標，可應用于監測宮頸病變進程和宮頸癌轉移、復發等。

本研究主要對健康獻血者血液樣本中的HPV載量進行了定量分析，之前針對獻血者血液中HPV的研究主要是定性的，未對HPV DNA進行定量分析。本研究結果顯示，獻血者HPV DNA陽性樣本的病毒載量比較低，為12.4～39.3拷貝/mL，平均為（21.3±8.27）拷貝/mL。血液中低病毒載量在臨床上的意義目前尚不清楚，不排除部分健康獻血者存在潛在的生殖道或者其他部位的HPV感染，亦或存在HPV感染史，還需要進一步研究。