攀枝花市沙門菌臨床分離株血清型和分子分型特征分析

陳 嫣， 崔 琳， 黃偉峰， 封正娟， 劉 玥， 許學斌

（1. 攀枝花市疾病預防控制中心，四川 攀枝花 617000；2. 上海市臨床檢驗中心，上海 200126；3. 四川省疾病預防控制中心，四川 成都 610000；4. 上海市疾病預防控制中心，上海 200336）

目前，沙門菌（Salmonella）已經成為影響人類健康的重要生態行為傳染病病原菌之一，其血清型有2 659個，依據臨床癥狀分為自限型、腸道腹瀉型和腸外侵襲型，暴露因素以食源性和養殖寵物等常見[1-2]。非傷寒沙門菌導致的散發與暴發疾病在歐美等發達國家屬首位疾病負擔的食源性疾病，該菌亦是我國公共衛生和食品安全領域最常見的食源性致病菌[2]。攀枝花市于2018年入選國家致病菌識別網的省屬監測點，基于優化的沙門菌臨床病例監測和定點醫院的實驗室確診病例，通過菌株表型復核、耐藥與分子分型特征分析，初步掌握本地區沙門菌血清型和耐藥與分子流行基線特征，為應對潛在的食源性或侵襲性散發、暴發疫情提供生物背景和溯源樣本參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2018—2019年攀枝花市4家哨點醫院基于優化監測方案培訓與病例的90株沙門菌臨床分離株，其中分離自腸道感染性腹瀉病例79株、腸外散發感染性病例11株（血流散發9株、傷口1株、尿液1株），菌株經攀枝花市疾病預防控制中心微生物實驗室鑒定確認。體外藥物敏感性試驗質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和分子分型質控菌株布倫登盧普沙門菌（H9812）由攀枝花市疾病預防控制中心微生物實驗室自行保存。

1.2 試劑和儀器

亞硝酸鹽煌綠增菌液、1型抗原誘導培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、沙門菌顯色瓊脂平板和腸道菌篩選雙糖管（上海安科生物制品有限公司）；沙門菌分型血清60種和適配誘導血清（丹麥SSI診斷公司）；14種抗菌藥物定量檢測板CHNMCMM（美國賽默飛世爾公司）；限制性內切酶XbaⅠ（英國Biolabs公司）；低熔點瓊脂糖、CHEF Mapper脈沖凝膠電泳儀和Gel DocXR凝膠成像儀（美國伯樂公司）；VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀、菌液比濁儀（法國生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 沙門菌血清型和臨床病例特征 收集90例沙門菌感染病例臨床流行病學特征數據，按腸道內和腸道外感染病例進行分類，將原發或繼發性血液（流）或體液感染病例定義為侵襲性沙門菌型；按照世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推薦的沙門菌O&H抗原標準化鑒定流程進行菌株血清型復核，基于同行驗證，并通過我國已公開的沙門菌型數據庫與國內、省內的沙門菌新菌型進行比對[2-3]。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗 按照我國國家致病菌識別網技術方案測試90株沙門菌對14種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢他啶、氨芐西林-舒巴坦、亞胺培南、四環素、萘啶酸、頭孢西丁、氯霉素、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、氨曲南、環丙沙星和復方磺胺甲噁唑）的耐藥性。折點判斷依據2019年美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準（耐藥率包含耐藥和中介菌株）[4]。多重耐藥菌（multiple-drug resistance，MDR）定義：至少同時耐3種和（或）以上不同類型抗菌藥物；ACT/S：耐氨芐西林（A）-氯霉素（C）-復方磺胺甲噁唑；ACT/ST：耐氨芐西林（A）-氯霉素（C）-復方磺胺甲噁唑（T/S）-四環素（T）。采用χ2檢驗（P<0.05）比較不同菌型菌株的耐藥率。

1.3.3 分子分型 按照國家致病菌識別網統一的沙門菌脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）參數對90株沙門菌進行分子分型和圖譜分析。以H9812為質量對照，限制性內切酶為XbaⅠ，37 ℃酶切2 h、電泳時間19 h。膠塊用GelRed染料（美國Biotium公司）染色30 min，用純水脫色60 min，圖譜經成像儀和BioNumerics（6.5）分析軟件作聚類與分析，聚類圖類型根據非加權配對算術平均法構建，要求最優化值為0.5%，條帶位置差異容許度為1.0%。

2 結果

2.1 沙門菌感染病例的臨床流行病學特征

2018年9月—2019年8月，攀枝花市4家哨點醫院90例沙門菌感染病例中，腸道腹瀉型和腸外侵襲型病例分別為79例（87.78%，79/90）和11例（12.22%，11/90）。沙門菌感染病例的三間分布特征顯示，男性病例明顯多于女性（性別比為55∶35）；病例年齡分布：<5歲（29例）、5～19歲（11例）、20～59歲（29例）、≥60歲（21例），病例相對集中在<5歲和成年人中；腸道腹瀉病例發病時間在2019年春夏季（尤其在5～7月）存在月度峰值（7月的腹瀉病例數接近20例），平均月度腹瀉病例超過10例；腸外侵襲型病例沒有明顯季節性，有2例腸炎沙門菌感染病例（17歲和76歲男性各1例）同時在其糞便和血液中分離到腸炎沙門菌。

2.2 沙門菌血清型特征

90株沙門菌臨床分離株經O&H抗原鑒定，有15種血清型，分布于A、B、C、D、E、H 6個群，以B群（56.70%）和D群（26.70%）的病例最多，居前5位的血清型分別為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌、倫敦沙門菌和韋太夫雷登沙門菌。侵襲性血清型包括腸炎沙門菌（6株）、甲型副傷寒沙門菌（2株）、鼠傷寒沙門菌（1株）、德比沙門菌（1株）和烏撒拉茂沙門菌（1株），其中烏撒拉茂沙門菌經同行驗證和攀枝花市醫學情報站查新確認，屬國內首次分離的侵襲性沙門菌血清型。見表1。

表1 90株沙門菌臨床分離株血清型分布

2.3 體外藥物敏感性試驗結果

90株沙門菌對14種抗菌藥物的耐藥率居前3位的依次為環丙沙星（64.44%）、頭孢唑啉（63.33%）、萘啶酸（60.00%）；MDR所占比例達48.89%；對復方磺胺甲噁唑、三代頭孢（頭孢他啶和頭孢噻肟）、亞胺培南、氯霉素、氨曲南和氨基糖苷類（慶大霉素）仍高度敏感。46株鼠傷寒沙門菌和24株腸炎沙門菌對氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、四環素、萘啶酸、頭孢唑啉、環丙沙星、復方磺胺甲噁唑等7種抗菌藥物耐藥和MDR構成差異有統計學意義（P<0.05）。有5株鼠傷寒沙門菌為ACT/S和ACT/ST耐藥型，而腸炎沙門菌無此耐藥型；腸炎沙門菌耐藥特征為高耐氟喹諾酮類和氨芐西林，對頭孢噻肟的耐藥率（20.83%）高于鼠傷寒沙門菌（8.70%），但差異無統計學意義（P>0.05），見表2。腸外的2株甲型副傷寒沙門菌除對萘啶酸耐藥，對環丙沙星中介外，對其他抗菌藥物均敏感。

表2 90株沙門菌對14種抗菌藥物的耐藥率 %

2.4 分子分型

90株沙門菌經過PFGE、圖譜聚類分析，整合包括血清型、耐藥表型等多維信息，確認血清型明顯優勢的鼠傷寒沙門菌存在3個不同程度的流行克?。?個為MDR克?。?9例）、1個為敏感克?。?8例），2個MDR克隆間的遺傳相似度較高；腸炎沙門菌存在1個高度同源、對氨芐西林（氨芐西林-舒巴坦）和氟喹諾酮（萘啶酸和環丙沙星）高耐藥的MDR流行克?。?1株）；3株倫敦沙門菌為典型MDR克??；3株斯坦利沙門菌對抗菌藥物完全敏感，且感染者發病時間相同，其中2株為同源性克??；2株韋太夫雷登沙門菌對抗菌藥物敏感，亦有同源性克隆特征。分子分型結合耐藥特征結果顯示，90株沙門菌前5種優勢血清型存在1個或多個典型的流行克隆。見圖1。

圖1 90株沙門菌PFGE聚類分析結果（限制性內切酶XbaⅠ）

3 討論

致病菌識別網是我國參考發達國家主動監測食源性病原菌網絡建立的傳染病監測網絡（PulseNet China）的升級版，但其本質還是被動監測。攀枝花市地處我國西南，毗鄰長江上游，氣候適宜，平均溫度為20 ℃，居住人口約120萬，經濟水平位居四川省前列，自2018年加入監測網絡后，基于醫防結合促進臨床實驗室掌握沙門菌分離和鑒定的技術關鍵點，通過結果共享提升傳染病網報精度，及時發現并報道了國內首例食源性暴露后繼發血流感染的烏撒拉茂沙門菌（SalmonellaUzaramo）的罕見病例，促進了醫療機構對臨床沙門菌感染診療技能的重視度[6-7]。

本研究4家哨點醫院的沙門菌感染病例反映了本地區沙門菌腸內和腸外感染特征。腹瀉型優勢血清型為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、倫敦沙門菌、斯坦利沙門菌、韋太夫雷登沙門菌，流行峰值在春夏季，男性病例多于女性，以<5歲幼兒（行為暴露）和20～59歲成人（食源性暴露）為主；侵襲性感染的優勢血清型為腸炎沙門菌、甲型副傷寒沙門菌，無季節發病特征。本地區腹瀉菌型特征與我國發達地區監測數據較一致：上海的鼠傷寒沙門菌低年齡組散發病例具明顯優勢（尤其在2012年之后），腸炎沙門菌在成年人組占優，符合食源性暴露特征[8-10]。美國自2012年之后，腸炎沙門菌成為腹瀉型的首位血清型[11]。本研究腸外侵襲性病例的菌型與美國和我國發達地區一致[12]：腸炎沙門菌替代甲型副傷寒沙門菌成為居第1位的侵襲性血清型，間接證明了城市經濟發展與衛生環境綜合治理成效的提升，潛在影響食源性疾病總特征趨向發達國家或地區的疾病譜。

本研究菌型和耐藥分析結果證實了攀枝花市沙門菌臨床分離株的整體耐藥性易受優勢血清型耐藥差異的影響。本研究中，鼠傷寒沙門菌MDR中和1類整合子有關的ACT/S和ACT/ST耐藥型僅有5株，對復方磺胺甲噁唑、三代頭孢、亞胺培南、氯霉素、氨曲南和氨基糖苷類抗菌藥物高敏感；腸炎沙門菌未見ACT/S和ACT/ST，但對萘啶酸、環丙沙星的耐藥率較高，與文獻報道[13]一致，且對頭孢噻肟的耐藥率超過20%，符合我國主流血清型的耐藥特征[14]，對其中產超廣譜β-內酰胺酶菌株的CTX-M酶基因型值得研究。本地區腸炎沙門菌對抗菌藥物的耐藥率高于鼠傷寒沙門菌，鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌的整體耐藥水平低于國內發達地區[10，12，14]，間接證實了抗菌藥物耐藥性與養殖動物生產和醫源性等對食源性感染性病原菌產生的不同影響，導致了同屬同血清型菌株出現的耐藥水平差異，而高耐藥克隆株更易在同屬同血清型菌株之間通過物流和人口流動發生傳播擴散[15-16]。

通過聚集血清型、耐藥性與分子分型，本研究發現腸內腹瀉的5種優勢菌型均存在不同程度的流行克隆。四川省內曾報道過鼠傷寒沙門菌的皮蛋克?。罕┌l的鼠傷寒沙門菌感染多數與家庭“皮蛋料理”加工冷菜有關[17]。本地區鼠傷寒沙門菌感染的臨床散發病例存在3個流行克隆，其生態來源的多源性特征值得繼續追溯；腸炎沙門菌單一MDR克隆病例呈高度散發，其對萘啶酸和環丙沙星均高耐藥的情況也值得警惕[13]，腸外侵襲性腸炎沙門菌的MDR將加重疾病負擔；病例相對較少的倫敦沙門菌MDR、斯坦利沙門菌、韋太夫雷登沙門菌均有穩定的克隆特征，提示根據血清型報告來發現和控制潛在食源性暴發的公共衛生監測是積極有效的[18-19]。

致病菌識別網可在區域經濟建設不斷發展和人口流動頻繁的情況下做好主要傳染病監測預警工作，但仍要應對各種挑戰，應持續加強基于臨床實驗室診斷、提高醫防合作的精準效率，共同應對人民群眾逐漸升高的蛋白質消費與供應鏈帶來的諸多食源性感染性疾病的防控挑戰與疾病負擔[1，20]。