呼和浩特地區腹瀉患者艱難梭菌毒素基因多位點序列分型研究

王艷艷， 王俊瑞， 鄭文琪， 申慧敏， 呂瑩瑩， 郭素芳

（內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010050）

艱難梭菌（Clostridium difficile）是一種專性厭氧、革蘭染色陽性的粗大芽孢桿菌，是醫院內抗菌藥物相關腹瀉和偽膜性腸炎的主要病原體[1]。為了解呼和浩特地區臨床腹瀉患者艱難梭菌感染情況，本研究對臨床疑似抗菌藥物相關腹瀉和偽膜性腸炎患者糞便樣本進行艱難梭菌分離和培養，并檢測艱難梭菌毒素基因，對產毒艱難梭菌進行多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST），為艱難梭菌感染的診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2018年7月—2019年12月內蒙古醫科大學附屬醫院疑似抗菌藥物相關腹瀉和偽膜性腸炎成人患者的糞便樣本326份。

1.2 試劑與儀器

艱難梭菌顯色培養基、厭氧產氣袋、VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀及配套ACT/ANC卡和VITEK MS微生物質譜鑒定系統（法國生物梅里埃公司），Efficiency 96基因擴增儀（北京領宇科技有限公司），聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）酶[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養及鑒定 將適量糞便樣本與無水乙醇按1∶1體積混合，靜置1 h后接種于艱難梭菌顯色培養基。35 ℃厭氧培養48 h。選擇顯色平板上黑色、邊緣不整，有特殊馬糞味的革蘭染色陽性大桿菌進行分離純化。采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀和VITEK MS微生物質譜鑒定系統進行菌種鑒定。

1.3.2 毒素基因檢測 采用熱激法提取細菌DNA，擴增艱難梭菌毒素基因（tcdA、tcdB）和二元毒素基因（cdtA、cdtB），明確是否為產毒艱難梭菌菌株。

1.3.3 MLST 參考文獻[1]擴增艱難梭菌7個管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi）。引物由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成，引物序列見表1。反應體系：2×pfu Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應程序：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物分析：取 5 μL PCR 產物，在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳（180 V，110 mA，20 min），溴化乙錠染色后，在凝膠電泳成像儀下觀察結果。擴增產物送中美泰和生物技術（北京）有限公司進行測序，測序結果通過http：//pubmlst.org/clostndium difficile進行比對，得到每株菌的ST型別。

2 結果

2.1 菌株鑒定及毒素基因檢測結果

326份糞便樣本中共分離出艱難梭菌46株（14.11%）。46株艱難梭菌中，有35株為產毒株，其中tcdA（-）、tcdB（+）型3株，tcdA（+）、tcdB（+）型32株，部分菌株電泳見圖1。未檢測到含二元毒素基因的菌株。

圖1 艱難梭菌毒素基因tcdA和tcdB檢測

2.2 MLST結果

35株產毒艱難梭菌的7個管家基因目的條帶均清晰可見。MLST比對結果顯示，35株艱難梭菌共檢出13個ST型別（2、3、14、33、35、39、42、48、52、54、55、109、512），其中ST54型的菌株數量最多，有 8 株（22.9%）；其次是ST2型和ST55型，各有5株（14.3%）。未檢測到高產毒株核糖體027型（ST1型）和核糖體078型（ST11型）。其中1株產毒菌株的7個管家基因擴增電泳見圖2。MLST結果見表2。

圖2 艱難梭菌 MLST管家基因PCR產物電泳結果

表2 35株艱難梭菌MLST結果

3 討論

艱難梭菌為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是醫院獲得性腹瀉最主要的病原菌。當廣譜抗菌藥物的應用破壞腸道正常菌群平衡時，產毒艱難梭菌會過度繁殖，導致腸道菌群失調，并釋放毒素，引起腹瀉。抗菌藥物被認為是導致艱難梭菌感染的最大危險因素[2]。目前，艱難梭菌感染已成為嚴重的全球性公共衛生問題[3]。

不同國家和地區對艱難梭菌感染的報道有較大的差異，BAUER等[4]對歐洲34個國家106所醫院的艱難梭菌相關腹瀉流行病學特征調查結果顯示，盡管歐洲各醫院艱難梭菌相關腹瀉流行情況有差異，感染率為0～36.3/萬（平均4.1/萬），但總體呈上升趨勢。我國艱難梭菌感染率或分離率為12.6%～18.5%[5-6]。有學者分析了24家醫院2009—2015年住院腹瀉患者的病因，發現19%的腹瀉是由艱難梭菌感染引起的[7]。本研究艱難梭菌檢出率為14.11%。由于艱難梭菌分離培養條件苛刻，對檢測人員要求較高，我國目前只有為數不多的臨床微生物實驗室開展了艱難梭菌的常規分離培養，導致艱難梭菌感染的實驗室診斷不足以滿足臨床診療需求。

艱難梭菌主要產生腸毒素A（tcdA）及細胞毒素B（tcdB）2種毒素，部分高產毒株還可以產生1種二元毒素（cdtA、cdtB）。本研究共分離出35株產毒艱難梭菌，其中32株艱難梭菌同時產A、B 2種毒素，3株艱難梭菌只產B毒素。不同地區報道產毒類型也不盡相同。本研究產毒艱難梭菌以tcd（A+B+）雙陽為主，未發現tcd（A+B-）型菌株，與文獻[8-9]報道一致，與同俏靜等[10]報道的54株產毒菌株中有53株tcdB（A-B+），僅1株為tcdA（A+B-），未檢測到雙陽性菌株的研究結果有差異，可能與不同地區流行菌株類型不同有關。

2002年以來，1種高產毒艱難梭菌在北美和歐洲暴發流行，即PCR-核糖體分型027型/脈沖場凝膠電泳分型NAPl型/限制性內切酶分型BI型（簡稱RT027/NAP1/BI）[11-12]。該型菌株引起的臨床癥狀更加嚴重，且傳播性更強，易復發、預后差，導致艱難梭菌感染發病率快速增加[12-13]。2005年，在荷蘭又發現了另1種高毒力菌株——核糖體分型078型[14]。目前，我國有高產毒株、多重耐藥菌株的個案報道，但沒有出現艱難梭菌感染的暴發流行。黃海輝等[15]首次在國內分離到高產毒株核糖體078型，我國香港和內地也相繼報道了艱難梭菌高產毒株核糖體027型[16-19]。

MLST是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法。該法通過PCR擴增多個管家基因內部片段并測定其序列，分析菌株的變異。MLST操作簡單，結果能快速得到，并且便于不同實驗室的比較，已經用于多種細菌的流行病學監測和進化研究。隨著測序速度的加快和成本的降低，以及分析軟件的發展，MLST逐漸成為常規的細菌分型方法。在我國，引起感染的艱難梭菌主要流行菌株為ST37型、ST35型和ST54型[20-21]。我國東部地區某教學醫院ST81型艱難梭菌在醫院內多病區播散[22]。有研究發現，ST81型艱難梭菌感染者的60 d死亡率明顯高于非ST81型感染患者，而ST81型也占艱難梭菌感染復發病例的大部分[23]。

本研究MLST結果顯示，呼和浩特地區艱難梭菌ST型別較多，有13種，主要型別是ST54型，其次是ST2型和ST55型。未檢出高產毒株ST1型（核糖體027型）、ST11型（核糖體078型）。本地區艱難梭菌感染以散發為主，未出現某一型別的暴發流行。