血紅素加氧酶和膽綠素還原酶反應化學研究進展

池肇春

山東省青島市市立醫院消化科 (山東 青島， 266035)

1 概述

在哺乳動物中，血紅素的分解代謝必不可少。血紅素首先被血紅素加氧酶(HO)裂解成線性四吡咯膽綠素Ⅸα(BV Ixα)，然后由膽綠素還原酶(BVR)轉化為膽紅素。HO利用NADPH細胞色素P450氧化還原酶(CPR)提供的3個氧分子(O2)和7個電子打開血紅素環，BVR通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)降低膽綠素。HOs的結構研究，包括底物結合、反應中間結合和幾種特定的抑制劑結合形式，揭示了底物與HO結合的細節和HO反應過程的機制。低溫捕獲結構和檢測遠端配體與血紅素鐵之間鍵的光解的時間分辨光譜研究表明，在HO反應過程中產生的CO是如何從反應位點解離的，HO的構象發生相應的變化。含有HO和CPR的復合物結構提供了電子如何轉移到血紅素HO絡合物的詳細信息。盡管BVR及其與NAD+的配合物的三級結構早在10多年前就已確定，但其催化殘基和反應機制仍不清楚。最近的一項關于藍細菌BVR與NADP+和底物BV的結晶學研究澄清了這些問題。兩個BV分子以堆積的方式與BVR結合，其中一個BV可以協助另一個BV的還原催化。最新生化、光譜和晶體學的研究，詳述了化學基礎上的分子機理的HO和BVR反應[1]。HO特異地切割血紅素的α位置，生成BV，Fe2+的線性四吡咯和CO。近年來，CO和NO都被認為是重要的信號分子。

CO通過NF-κB通路參與炎癥、細胞增殖和分化。該分子通過半胱氨酸β合成酶途徑還調節血管擴張和血管收縮。通過神經元PAS結構域蛋白2(NPAS 2)途徑調節晝夜節律,并存在細胞生長、分化凋亡、腫瘤生長抑制等多方面作用[2，3]。

哺乳動物HO由一個可溶性催化結構域和一個C末端膜結合段組成。HO與底物血紅素形成1∶1復合物，并將其轉化為BV。具體而言，從血紅素轉化為α-羥基血紅素，再從α-羥基血紅素轉化為α膽綠蛋白血紅素(α-verdoheme)，最后從α-verdoheme轉化為BV[4]。第二步和第三步分別釋放CO和黑色鐵。哺乳動物HO需要電子來進行這些單加氧酶反應，這些電子由NADPH-細胞色素P 450氧化還原酶(CPR)提供。

如果膽紅素不被氧化為膽綠素，則UDP-葡糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1)與肝細胞中的葡萄糖醛酸結合，使其更易溶于膽汁。結合膽紅素通過ATP依賴的多藥耐藥蛋白轉運體MRP[5]，一旦進入腸道，結合膽紅素就會被微生物區系還原為尿膽紅素原，并進一步代謝為甾體比林或尿比林，它們分別在糞便和尿液中排泄[5-7]。然而，膽紅素并不僅僅是血紅素分解代謝的廢物，它也是一種有效的抗氧化劑，特別是保護脂質免受氧化。在過去的10年里，膽紅素的作用已經擴大，為一種炎癥保護的工具[8，9], 包括糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征、肥胖等疾病，特別是慢性肝病。據報道，在接受常規健康篩查的患者中，血清總膽紅素水平升高與代謝相關脂肪性肝病(MAFLD)和代謝相關脂肪性肝炎(MASH)呈負相關[10]。在肥胖兒童中，經肝臟超聲診斷為MAFLD者血清總膽紅素水平低于無MAFLD者。Puri等[11]調查診斷為MAFLD的兒童，觀察到MASH患者血清總膽紅素水平顯著降低,此外，血清總膽紅素水平與脂肪變性程度和MAFLD活性評分呈負相關(P<0.05)。這些研究支持膽紅素對慢性肝病的進展和發展起到保護作用。

2 HO的性質

哺乳動物HOs是一種重約33 kDa的蛋白質，C末端段錨定在微粒體膜上，截短的可溶性HO形成單體。該蛋白有兩種亞型，即HO-1和HO-2。HO-1在脾臟和肝臟中高表達，主要由衰老的紅細胞降解血紅素。HO-2對HO-1的誘導劑完全不敏感，在大腦和睪丸中都有表達。藍藻和植物的HOs是可溶性蛋白，以多種亞型形式存在。

HO在特定的位置與血紅素結合，形成血紅素-HO配合物，然后激活分子氧(O2)使用底物血紅素。HO的血紅素配合物具有與其他血紅素蛋白類似的光譜性質，如肌紅蛋白和血紅蛋白[12]。鐵血紅素-HO配合物在中性pH下以六配位高自旋態存在，經Raman光譜和EPR(電子順磁共振)光譜分析，在堿性pH下轉變為低自旋態[13]。保守的殘基位于N端附近，被認為是血紅素鐵的配體。血紅素-HO的一個特點是它對CO的親和力與O2的親和力幾乎相等。眾所周知，其他血紅素蛋白如肌紅蛋白和血紅蛋白對CO的親和力遠高于O2。激活O2是HO反應的關鍵過程。HO是一種α螺旋蛋白。血紅素群被A-、B-和F-螺旋包圍，血紅素鐵由His殘基(大鼠HO和人HO中His 25)在A-螺旋中協調。F螺旋位于血紅素的遠端。有趣的是，血紅素的遠端沒有側鏈，與血紅素鐵最接近的殘基是甘氨酸。晶體結構分析表明水分子或OH-在鐵血紅素結合狀態下與血紅素鐵配位。血紅素的取向是由HO的堿基殘基與兩個血紅素丙酸基團之間的靜電相互作用維持的。對電子密度圖的仔細觀察發現，血紅素的一小部分在連接α和γ位置的軸心周圍以倒轉的方式與HO結合，這與核磁共振分析結果是一致的[9]。

3 血紅素結合對HO結構的影響

在大鼠載脂蛋白血紅素加氧酶-1(apoHO-1)的晶體結構中，血紅素結合位點發生了較大的構象變化。用核磁共振技術測定了大鼠HO-1的構象動力學，闡明了HO-1識別血紅素的機制[14]。核磁共振弛豫實驗表明，在晶體結構中，大鼠apoHO-1A-、B-和F-螺旋發生波動，并與表面暴露環(CD-環)和CD-環瞬間形成部分展開結構。波動的CD-環位于血紅素結合位點的17個以上，這個環的功能是未知的。在試圖闡明這一環的功能時，發現有趣的突變改變了活動，但幾乎沒有引起構象的變化。CD環中苯丙氨酸79丙氨酸(Phe79Ala)突變通過促進構象波動調節血紅素結合的構象變化。此外， CD-環接近CPR在CPR-HO復合體中的交互位置。因此，血紅素與HO-1的結合可能通過控制血紅素結合位點和CD環的波動而影響CPR與HO-1的親和力。

4 CO或氰化物結合血紅素引起的構象變化

血紅素與Lys 179之間發生氫鍵的斷裂。此外，在CO結合的血紅素-大鼠HO-1晶體中，當Fe-CO鍵被光解時，觀察到遠端F-螺旋和血紅素鐵的反構象變化[15]。用時間分辨共振拉曼光譜觀察了血紅素-血紅素-HO-1配合物在CO解離后的這種動態結構變化[16]。在亞納秒和微秒時間分別觀察到組氨酸鐵(Fe-His)拉伸和丙酸血紅素彎曲共振拉曼譜帶的時間變化。這些變化表明，在CO解離后，Fe-His鍵的結構重排和血紅素丙酸鹽橋的結構重排。Fe-His拉伸模式在解離后表現出高達30 μ的上移，這是第1個例子，在CO解離引起的伸展Fe-His連接在血紅素蛋白。

5 BV鐵螯合配合物HO的結構

當HO反應第3步完成時，生成血紅素裂解產物BV-鐵螯合物，從HO中釋放出Fe2+和BV。測定了BV-鐵螯合鐵結合大鼠HO-1的晶體結構，發現BV-鐵螯合鐵的四吡咯部分呈扭曲的U形構象(zzz、sss構型)[17]。在電子密度圖中未發現暴露于表面的丙酸基團。鐵原子到5個氮原子的距離，包括His 25的Nε原子，相對于血紅素-HO-配合物中觀察到的氮原子的距離增加。保留了包括Asp140在內的氫鍵網絡。當該結構與膽綠蛋白血紅素-血紅素加氧酶(verdoheme-HO)結構相比較時，血紅素遠端的構象發生了明顯的改變。F-螺旋位的氫鍵方案由π-螺旋構象轉變為α螺旋構象，而G_(139)羰基氫鍵伙伴由G_(144)酰胺基改變為G_(143)。這種微妙的變化導致F-螺旋的方向改變，血紅素口袋變寬。因此，Fe3+原子和BV可以從HO中釋放出來，Fe3+原子被還原。

6 抑制HO活性的化合物

包括金屬卟啉抑制劑在內的幾種HO抑制劑。在這些HO抑制劑中，合成了咪唑-二惡烷類化合物作為哺乳動物HOs的抑制劑。這類抑制劑的特點是在誘導性HO-1和組成性Ho-2酶之間具有選擇性。大量的抑制劑分子占據了狹窄的遠端口袋，導致遠端F-螺旋的開放構象和遠端氫鍵網絡的替換。血紅素丙酸基團的構象變化與CO引起的構象變化相似。生物化學表征顯示，在咪唑二氧戊環化合物(DIOCPI)與抑制劑結合的血紅素與氧的反應性相比，形成二氫萘后，HO-1和HO-2的催化反應完全停止。這一結果主要是由于抑制劑結合的釩與氧的反應性較低所致。DIOCPI的4-氯苯基占據了由苯丙氨酸和蛋氨酸殘基的側鏈組成的疏水腔，其中CO被瞬間捕獲。DIOCPI占據血紅素鐵的遠端，從而抑制血紅素-HO向O2的轉化。然而，生化研究表明，DIOCPI嚴重抑制了膽綠蛋白血紅素向膽綠素-鐵螯合物的轉化[18]。合成了多種化合物來選擇性地抑制HO-1和HO-2，通過對相關咪唑-二惡烷類化合物與人類HO-1結合方式的研究發現，所有這些化合物都以類似的方式與HO-1結合[19]。雖然對具有高選擇性的抑制劑進行了廣泛的研究，但這些化合物對HO-1和HO-2選擇性的結構機制仍不確定。

據報道，替代化合物在血紅素的遠端結合，這些化合物通過破壞氫鍵網絡而抑制HO的活性[20]。DL-二硫蘇糖醇(DTT)和二硫代赤蘚醇(DTE)具有較高的親和力。DTE對HO -1的選擇性比HO-2較高，測定了DTT-和DTE結合的大鼠血紅素-HO-1和血紅素-HmuO(HmuO基因是白喉棒狀桿菌利用血紅素和血紅蛋白作為鐵源所必需的；HmuO的產物與真核生物血紅素加氧酶具有同源性，后者參與血紅素的降解和鐵的釋放)的晶體結構。DTT與巰基末端的血紅素鐵結合，兩個羥基與環境氨基酸相互作用。在DTT-血紅素-HO-1和DTE-血紅素-HmuO配合物中，DTT和/或DTE占據血紅素的遠端，且缺乏HO反應所必需的氫鍵網絡[1]。

7 哺乳動物的BVR特性

HO產生的BV被BVR進一步轉化為膽紅素。從大鼠肝、豬脾和人肝中分離純化BVRs。據報道，BVR以兩種異構體的形式存在，即BVR-A和BVR-B。BVR-A是成人肝臟中主要的BVR形式，催化α-位血紅素裂解產物BV(Ⅸα)還原成BR(Ⅸα)。BV(Ⅸβ)是另一種位于β位置的血紅素裂解產物，被BVR-B還原形成B(Ⅸβ)。在成人中，BV異構體的比例為95%～97%Ⅸα和3%～5%Ⅸβ。

8 BVR的晶體結構

在20年代初對大鼠BVR進行了晶體化和晶體結構測定[21]。BVR由兩個結構域組成，即N-末端二核苷酸結合域和C-末端結構域。N端二核苷酸結合域由一個α/β二核苷酸結合基序組成，這是一個典型的羅斯曼折疊，其中一個平行的β片被6個α螺旋包圍。C終端領域最顯著的特點是一個大的、扁平的、六股β片。這張紙的一面主要是極性和帶電殘留物的溶劑，從而形成一個平面表面在分子的一端。NAD配合物大鼠BVR晶體結構的研究也確定了，NAD+被綁定到N端和C端域之間的縫隙上[22]。在大鼠BVR中，NAD氫原子周圍的殘留物包括Tyr 97、Ser170和Arg 172。將這些殘基突變為其他殘基不會導致完全失活[23]。雖然基底BV可能在該位點附近結合，但確切的BV結合位點和模式尚不清楚。

9 BVR的新功能

最近的研究已經建立了新的功能，其中之一是DNA結合能力。Maines小組報告，人類BVR與HO-1啟動子區域(稱為ap-1位點)結合和激活轉錄因子-2(ATF-2)啟動子，ATF-2是激活cAMP反應元件cAMP的轉錄因子, 是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族中與特定序列相結合的DNA結合蛋白。在調控正常細胞的生長發育、應激反應、DNA損傷應答中發揮作用。ATF-2需形成同二聚體或與其他bZIP蛋白如c-Jun形成異二聚體而發揮轉錄活性。ATF-2具有致癌與抑癌雙重功能[24]。這些啟動子區域具有相似的序列(TGTAGTCA)。因此，通過調節HO-1和ATF-2的表達，使人的BVR在細胞信號傳導中發揮作用是可行的。

BVR的另一個未被發現的特點是它作為絲氨酸/蘇氨酸激酶的功能。氧自由基促進BVR激酶活性，該酶在cGMP和氧化應激作用下的活性與BVR易位到細胞核中同時存在[25]。BVR的氨基酸序列包含一個堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZip)樣的基序，bZip是一種轉錄因子，它通常存在于受細胞信號調節的激活劑中，對基因表達與調控起重要作用[26]。

綜上所述，這些觀察證實BVR是一種多功能酶。然而，BV還原、DNA結合和激酶活性等功能的分子機制尚不清楚。需要進一步的研究才能確定BVR的確切生理作用。