華法林藥物基因組學的應用

趙鑫龍，楊杰孚

（1.北京醫院心血管內科/國家老年醫學中心/中國醫學科學院老年醫學研究院，北京 100730；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100005）

華法林從20 世紀40 年代被發現以來，憑借價格低廉，口服后經腸道快速吸收等優點，成為了包括靜脈血栓栓塞性疾病的一級和二級預防、心房顫動血栓栓塞的預防、瓣膜病、人工瓣膜置換術和心腔內血栓形成等需長期抗凝治療患者的常用藥物。但使用華法林需長期檢測國際標準化比值（international normalized ratio，INR）、藥物起效及代謝失效時間長短不一等，目前有達比加群酯、利伐沙班、依度沙班等多種NOACs 新型口服抗凝藥物（Novel oral anticoagulants，NOACs）的研發，為疾病的治療提供更多的選擇。雖然華法林劑量選擇靈活，但針對不同人個體化差異較大，藥物使用的不良事件也屢見不鮮。近年來越來越多的研究證實遺傳因素對華法林穩態劑量的潛在影響，但是否利用遺傳信息等變量指導華法林的使用仍存在不少質疑。諸多國內外學者致力于華法林基因組學的前瞻性研究，建立了多個給藥模型，試圖通過基因指導給藥。本文就目前華法林基因組學的主要研究成果的基礎上，對華法林個體化治療的應用進展進行綜述。

1 華法林藥物作用機制和藥代動力學

華法林是一類雙香豆素衍生物，其可通過抑制維生素K 環氧化物還原酶（VKOR）發揮作用[1]。VKOR 主要由VKORC1 基因編碼。通過影響氧化型維生素K 轉變為還原型維生素K，從而影響凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和蛋白質C、S、Z 氨基末端谷氨酸殘基的羧化反應，造成凝血因子無法激活活化，達到抗凝作用[2]。華法林經口服后進入胃腸道可被快速吸收，入血后主要與白蛋白結合，通常90 min 左右血藥濃度達高峰。目前臨床上使用的華法林是消旋酸光學異構體的混合物，包括了S 型和R 型華法林，其中S 型的效能是R 型的3～5 倍，S 型占據了華法林效應的60%～70%。兩者通過不同的代謝途徑在肝臟中代謝清除，S 型華法林具有約1.5 倍的全身清除率，比R 型華法林有效5 倍[3]。S 型華法林主要通過CYP2C9 代謝，可將S 型華法林催化成為無活性形式S-6-羥基或S-7-羥基華法林；而R 型華法林主要通過CYP1A2、CYP1A2、CYP3A4 和酮還原酶在肝臟中代謝為無活性的R-10-羥基華法林[4]。

2 華法林藥物基因組學

2.1 細胞色素酶P450 2C9（CYP2C9）主要存在于肝臟、腸道細胞內質網上的細胞色素P450 家族（CYP）催化體內多種內、外源物質，其中CYP2C9 是編碼細胞色素P450 家族酶2C9 蛋白（與華法林代謝酶活性有關）的基因，編碼CYP2C9 蛋白的基因主要位于10 號染色體長臂（10q24.2），全長約為50 kb，包含9個外顯子和8 個內含子，可讀框長度為1472 bp。CYP2C9 基因具有多態性，其主要取決于編碼區的SNPs[5]，目前已命名的SNPs 有62 種，分別以CYP2C9*1-CYP2C9*62 命名[6]。相關報道中出現最多的SNPs 為野生型CYP2C9*1、雜合突變型CYP2C9*2 和CYP2C9*3[7]。野生型的等位基因決定酶的活性，具備了正常酶代謝的高度活性，而突變型所編碼的酶活性則相對有所降低。

CYP2C9 基因頻率的分布存在明顯差異。就種族而言，歐洲人群中最為常見，且研究最為廣泛的突變是CYP2C9*2 和*3[8]。對于我國人群，Dai DP 等[9]根據我國漢族人群CYP2C9 分布建立的基因庫顯示，CYP2C9*1、*3的出現頻率為94.48%、2.94%，而CYP2C9*2的出現頻率并不高。由此可見，亞洲人群中CYP2C9*2 型突變較為罕見，90%以上的亞洲黃種人為野生型CYP2C9 *1。有研究表明[10]，CYP2C9基因多態性與抗凝治療期間抗凝過度及出血并發癥風險可能相關，因此明確基因型對合理抗凝起到重要作用。

2.2 VKORC1 基因 VKORC1 編碼的蛋白質為組成維生素K 環氧化物還原酶復合體（VKORC）亞單位之一，其是維生素K 依賴性凝血因子生成的限速酶，同時也是華法林的作用靶點。VKORC1 基因位于位于16 號染色體短臂（16p11.2），全長約為100bp，包含3 個外顯子。在VKORC1的編碼區和非編碼區存在較多的SNPs，其中對華法林使用劑量有影響的SNPs 主要位于：啟動子區1639 位置G＞A，第一個內含子1173 位置C＞T[11]。VKORC1-1639GG和VKORC1-1173CC 稱為野生型。與攜帶野生型個體所需的華法林劑量相比，攜帶雜合型1639AG 和1173CT的個體所需劑量較少。1639AA 和1173TT為純合子的突變體，其攜帶者所需華法林劑量相比野生型更少[12]。在高加索人群中VKORC1-1173 等位基因TT、CT、CC 分布頻率為16.3%、46.9%、36.8%，日本人群84.9%、15.1%、0，而在對我國漢族人群中其分布頻率分別為81.4%、15.1%、2.5%[13]。高加索人群中VKORC1-1639 等位基因AA、GG、AG分布頻率為14%、47%、39%，而在我國漢族人群中為80%、18%、2%。由此看來VKORC1 基因型在不同人種中分布不同。甚至一些研究顯示[14]，亞洲不同地區VKORC1 基因型分布也存在差異，表現為1173-TT 和1639-AA 由東向西出現頻率的遞減。因此，上述研究可以很好的解釋不同人種、不同地域的個體對于華法林劑量需求的不同。

2.3 CYP4F2 基因 CYP4F2 是編碼細胞色素P450家族酶之一，基因位于19 號染色體短臂（19p13.11），作為一種維生素K1的單氧酶，可將維生素K1氧化為羥化的維生素K1，從而導致所需華法林劑量增多。目前部分研究發現CYP4F2*3（rs2108622）與華法林劑量顯著相關，CYP4F2*3 主要位于11 號外顯子，單核苷酸C 突變為T，造成蛋白水平的改變[15]。檢索目前相關基因與華法林劑量相關的文獻中發現[16，17]，黃色人種基因型為CC，CT和TT 所對應的基因型頻率分別為52.68%，39.47%和7.85%；其他人種（黑色人種和白色人種）基因型為CC，CT 和TT 所對應的基因型頻率分別為27.75%，36.30% 和35.94% 。有研究顯示[18]，CYP4F2 基因的多態性可以影響我國漢族人群開始口服華法林抗凝治療初始7 天的劑量，其研究中顯示基因型TT的患者所需的華法林劑量（3.67±0.75）mg/d，而表現為CC 型的患者則需要（3.20±0.75）mg/d（P＜0.05）。CC 型患者使用華法林后INR首次進入治療窗時間為（3.41±1.6）d，而基因型為TT的患者則需要（4.22±1.6）d（P＜0.05）。Li J 等[19]認為CYP4F2 基因多態性雖然對華法林的使用劑量有影響作用，但其作用低于CYP2C9、VKORC1 等遺傳變量的影響。因此，對于CYP4F2 基因型是否對個體華法林劑量的影響仍需更進一步的研究和論證。

2.4 其他華法林藥物代謝相關基因

2.4.1 載脂蛋白E（APOE）APOE 可參與富有維生素K的載脂蛋白向肝臟轉運，主要由APOE 基因負責編碼，存在三種突變類型。Yu WY 等[20]在2016 年對186例機械瓣置換術后口服華法林的患者進行基因測序時發現，APOE E2、E3、E4 等位基因頻率分別為11.6%、82.5%、5.9%，人群中未檢測到E2/E2 或E4/E4的基因型。之后經分析發現APOE E2/E3、E3/E3 和E3/E4 基因型攜帶者華法林的使用劑量存在顯著差異（P＜0.05）。進一步對比發現E2/E3雜合子攜帶者的華法林每日維持劑量顯著高于E3/E3 純合子攜帶者（P＜0.05），而攜帶E3/E4 與E3/E3、E2/E3 與E3/E4的患者華法林劑量需求之間卻無顯著差異（P＞0.05）。

2.4.2 EPHX1 EPHX1 基因主要編碼微粒體環氧化物水解酶（mEH），位于1q42.12 有9 個外顯子和8個內含子。EPHX1 主要分布于肝臟內質網上，其基因多態性可使mEH的活性下降，從而通過影響維生素K 還原，來影響維生素K 依賴性凝血因子的活化過程[21]。國內外學者針對EPHX1 基因多態性也做出了不少研究，韓國學者[22]在2018 年對201例口服華法林的患者的16 個單核苷酸多態性進行檢測，經多因素分析后發現EPHX1 rs1877724 基因位點對華法林穩定劑量有影響，劑量變異率占1.5%；國內學者研究發現[23]，EPHX1 rs2260863的非變異CC 純合子與GC 雜合子相比，攜帶者華法林每日劑量需要顯著降低。就目前的相關研究看來，部分研究成果可以解釋小部分EPHX1 基因多態性與華法林劑量有相關性，但相較來說還是缺乏大規模的臨床試驗研究進一步證明。

2.4.3 GGCX γ-谷氨酰胺羧化酶主要由GGCX 基因所編碼，其位于2 號染色的短臂，由15 個外顯子組成。GGCX 直接參與翻譯羧化，可使維生素K 依賴性的凝血因子以及蛋白C、S、Z 上的γ-谷氨酸殘基發生羧化，使其成為有活性的凝血因子參與凝血過程[24]。GGCX 基因突變時，γ-谷氨酰胺羧化酶活性下降，GGCX 活性也同時下降，從而引起凝血因子活化異常，導致華法林使用劑量增加[25]。一項針對[26]我國新疆地區漢族房顫患者GGCX 基因rs11676382 位點多態性與華法林穩定劑量關系的研究中發現，基因型為CC、CG 和GG的患者華法林穩定劑量各不相同，CC 型所需劑量明顯多余GG 型。另一項針對云南漢族人群GGCXrs699664 位點多態性的研究顯示[27]，包括純合子AA、GG 型、雜合子AG 型在內，3種不同基因型在心臟瓣膜置換術后所需華法林穩定劑量不同，分別是AA 型（3.507±1.44）mg/d；AG 型（3.46±1.236）mg/d；GG 型為（3.092±1.044）mg/d。目前國內外對于GGCX 基因多態性與華法林穩定劑量的研究結果較少，因此如需判斷二者相關性，仍需許進行大規模的研究以進行證實。

2.4.4 NR1I2 孕烷X 受體（PXR）可由NR1I2 基因編碼，其主要作用為調控CYP 酶，參與藥物轉運等[28，29]。在一項納入201例接受華法林抗凝治療患者的研究中發現[30]，PXR rs2472682（A＞C）與華法林穩定劑量顯著相關，該變種純合子攜帶者所需的華法林日劑量明顯低于攜帶野生等位基因攜帶者。同時該研究通過建立多元回歸預測模型，最終可以解釋43.7%的華法林劑量個體差異。

2.4.5 細胞色素P450 氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）POR 是人肝微粒體細胞色素

P450 酶的唯一電子供體，其遺傳多態性可能對一些藥物代謝有部分影響[31]。有研究認為[32]，在CYP2C9*1患者中，POR rs17685 基因型中含T 等位基因攜帶者（CT、TT）華法林維持劑量（3.50±1.07）mg/d 要高于C等位基因攜帶者（CC）所需劑量（3.14±0.94）mg/d（P=0.03）。但由于缺少大規模的臨床研究，因此POR及其多種SNPs 與華法林穩態劑量的關系仍有待進一步研究。

3 根據華法林基因多態性建立的藥物劑量預測模型

華法林作為經典的口服抗凝藥物，優點與缺點并存。個體間劑量差異大，傳統的給藥模式需要長期檢測INR 進行劑量調整，導致使用華法林達到治療窗時間及出血事件風險都變得難以掌控。因此國內外不少學者根據上述對華法林劑量有影響的因素，運用統計學方法推斷出個體使用華法林穩定劑量預測模型。這些模型大部分都是基于年齡、體重、性別、種族以及華法林相關基因等因素所構建的多元性線性方程，其中有效應用藥物基因組學信息指導華法林給藥的預測模型，可以解釋40%～60%的華法林劑量個體差異。眾多的預測模型中絕大部分是將CYP2C9 和VKORC1 基因作為遺傳預測因素。其中CYP2C9 主要測序分析*2 和*3的等位基因，而VKORC1 基因主要考慮-1639G＞A 或-1173C＞T 兩種SNPs[33]。

國際華法林組織所指導的一項多中心研究的結果，建立了目前最為經典及使用廣泛的IWPC 預測給藥模型[34]。其納入包括了來自9 個國家不同種族的4043例服用華法林并達到穩定治療劑量（INR2-3）的患者，在進行驗證隊列中，該研究計算了華法林預測劑量在實際穩定治療劑量20%范圍內的患者百分比。研究發現與臨床算法和固定劑量方法相比，遺傳算法能夠更準確地預測高劑量和低劑量組華法林患者的治療劑量。因此，IWPC 研究證明了基因型指導給藥算法的優勢。目前國內外研究推算出的預測模型多是基于大量回顧性研究，與傳統固定的用量給藥相比，這些基于基因型多態性的預測模型可實現個體化給藥，從而減少出血及栓塞事件，提高用藥的安全性。

4 總結

盡管NOAC的應用不斷增加，但華法林仍有著易于獲取、價格低廉、適應癥廣泛等獨特的優勢，尤其是在全球醫療負擔不斷加重以及部分醫療資源有限地區患者仍無法接受及時抗凝治療的背景下。與此同時，利用基因檢測識別出不同程度華法林敏感度的個體，再考慮應用NOAC 或華法林抗凝治療，能有效降低患者出血事件的風險。近年來針對我國漢族人群華法林基因多態性的研究取得了一系列重要的進展。因此，探索這些新的基因突變對華法林維持劑量的影響，對建立我國漢族人群特異的華法林藥物遺傳學算法，指導我國漢族患者精準化、個體化地華法林給藥有著重要的意義。