基因編輯技術在疾病中的應用及研究進展

董田玉 劉遠遠 段思琦 付雪瑞 常彥忠

1河北醫科大學解剖教研室,石家莊050017;2河北師范大學鐵代謝分子生物學研究室,石家莊050024;3河北醫科大學期刊社,石家莊050017;4河北醫科大學大型科研儀器設備共享服務平臺,石家莊050017

基因編輯技術主要包括鋅指核酸酶 (zinc finger nucleases,ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALEN)、規律性重復短回文序列簇 (clustered regularly interspaced short palindro mic repeats/cas endonuclease,CRISPR/Cas)系統。近年來,CRISPR/Cas系統在基因工程領域取得了重要突破。該項技術雖然研究時間不長,但在生物研究和醫學領域產生了重大影響。在人類疾病中,呼吸系統類疾病高居癌癥死亡率之首,科學家利用CRISPR/Cas基因編輯技術在治療肺癌等疾病中進行了深入研究,并獲得重大突破。本文重點介紹了近年來基因編輯技術及其在呼吸系統等疾病中應用及其研究進展。

1 基因編輯技術

1.1 ZFN 編輯技術 鋅指蛋白是上世紀80年代由科學家在非洲爪蟾的轉錄因子中發現,后逐步發展完善成為較早的一類人工編輯基因組的技術[1]。ZFN 由特異識別DNA的鋅指蛋白和FokⅠ核酸內切酶的剪切結構域兩部分構成,是一種人工合成的融合蛋白。將人工設計產生的鋅指蛋白與非特異性FokⅠ剪切結構域結合形成具有活性的二聚體,即可對目標基因進行特異剪切。ZFN 作為第一代被廣泛使用的基因剪切工具,在小鼠、大鼠、斑馬魚及人類細胞中的技術建立已經較為成熟。2003年,科學家成功地利用該技術對果蠅和人類細胞的基因進行編輯[2]。但是由于ZFN的設計復雜,構建時間長并且成功率低,不能廣泛的被實驗室掌握,因此該技術的發展與應用在一定程度上受到了阻礙。

1.2 TALEN 技術 隨著對基因編輯技術的深入研究,TALEN 技術逐漸取代了ZFN 技術,成為第二代基因編輯技術[3]。TALENs 核酸酶是由特異識別結合DNA 的TALE蛋白和FokⅠ核酸內切酶融合組成。TALE 蛋白是一類從植物病原菌黃單胞菌屬分離出的效應蛋白,識別靶標序列,同樣地利用限制性核酸內切酶FokⅠ對基因組進行編輯。2009年,Moscou和Bogdanove[4]發現了TALE蛋白特異識別并結合DNA 的作用機制。2011 年,Sander等[5]將改造的Tale 蛋白與FokⅠ核酸內切酶構建了TALEN 技術,并證實其能定向修飾基因組。此后,有大量實驗證明該技術在人類細胞、小鼠、大鼠、斑馬魚等不同物種均適用[5]。與ZFN 相比,在識別靶序列的特異性上,TALEN 更具優勢。此外,TALEN 的毒性低,蛋白設計也相對簡單,因而成為基因治療研究中的有力工具。但是,其重復序列多,工作量大,在實驗室廣泛應用仍存在困難。

1.3 CRISPR/Cas技術 CRISPR/Cas技術是第三代基因編輯技術,開啟了基因編輯技術領域的新篇章[6]。CRISPR/Cas系統是一種適應性免疫系統,通過靶向DNA或RNA 來保護微生物免受外來核酸 (如噬菌體)的侵襲,約50%的細菌種類和迄今為止幾乎所有的古細菌物種都有這種系統[7]。該系統的顯著特征是在基因組上含有CRISPRarray序列,由富含AT 的前導序列和串聯重復序列組成,這些串聯重復序列又被序列特異的間隔隔開。CRISPR/Cas系統抵抗外源DNA 入侵。CRISPR/Cas系統通過三個階段介導適應性免疫 (免疫和防御)[8]:首先,適應階段,當病毒或其他外來遺傳物質入侵時,細菌將部分外源的DNA 捕獲并整合到CRISPR array的串聯重復序列中,形成新的間隔序列。其次,表達階段,將CRISPR array轉錄并加工成單獨的cr RNA,每個cr RNA 帶有病毒或質粒的RNA 片段以及CRISPR 重復序列的一部分成為成熟的cr RNA。第三,干擾階段,cr RNA 引導Cas蛋白的復合物或單個Cas蛋白對入侵者進行切割,最終達到免疫的效果。

CRISPR 有很多變化,而且CRISPR/Cas系統也具有廣泛的自然多樣性,包括靶向DNA 的系統、靶向RNA 的系統以及同時靶向DNA 和RNA 的系統。CRISPR/Cas系統也以不同的方式運行,通過各種效應子-cr RNA 復合物介導的不同機制識別和切割其核酸靶點。根據其獨特的效應蛋白,CRISPR/Cas系統目前分為6種類型 (Ⅰ～Ⅵ),又分為兩大類:1類系統 (TypeⅠ、TypeⅢ和TypeⅣ型)使用多個Cas蛋白復合物來實現免疫應答,2類系統 (TypeⅡ、TypeⅤ和TypeⅥ型)利用單個核酸酶Cas效應子進行免疫應答[9-10]。例如屬于TypeⅡ型系統的Cas9,只需要Cas9蛋白即可與成熟的cr RNA 組裝成RNP復合物對DNA 進行切割[11-12]。2013 年,CRISPR/Cas技術正式用于DNA 編輯修飾中[13]。與前兩種基因編輯技術相比,該技術的構建成本更低、操作更加便捷、編輯效率也更高效。其不斷地研究發現為生物學及臨床應用領域的發展帶來了巨大變革,在基因治療領域具有廣闊的應用前景。

2 基因編輯技術在疾病中的應用

2.1 疾病模型中的應用 CRISPR/Cas9技術對生物學研究發展最直接的影響之一是建立植物、動物和細胞模型。首先,因為CRISPR/Cas9技術極大地減少了修改傳統真核生物模型和細胞系基因組所需的時間和精力 (酵母除外,對于酵母而言,已有數十年的強大基因操作工具)。其中一個關鍵的例子是基因敲除小鼠的產生。在2013年之前,基因敲除小鼠是用改良的胚胎干細胞制造的,整個過程需要1～2年,而Cas9介導的基因敲除可以在幾周到幾個月內完成[14-15]。最近,有學者提出可以通過使用Cas9介導的基因驅動方法來進一步加速定制小鼠模型的產生[16]。這種方法也適用于創建非人類靈長類動物模型[17]。同樣,CRISPR 工具易于重新編程,使其得以大規模應用,從而快速創建細胞系庫。其次,CRISPR/Cas9技術可以容易地處理多種其他生物的基因,包括寄生蟲、微生物和非模型生物[18],例如甲殼類動物[19]、黃蜂[20]、蝴蝶[21]和硅藻[22]。第三,CRISPR/Cas9技術被用于創建特定的動物和細胞模型,以重現在人類患者發現的基因變異[23]。這些特定的模型使疾病模型更加精確,可用于了解一系列人類疾病的分子病理學,并開發新的治療策略來治療這些疾病。例如,通過Cas9介導的基因編輯創建了亨廷頓舞蹈癥的豬模型,從而可以在相關的動物模型中研究這種疾病[24]。第四,Cas9可在體內加速構建疾病模型,例如癌癥[25-26]。此外,已經創建了d Cas9-EGFP 敲入小鼠,可以輕松、動態地跟蹤目標基因組區域[27]。利用這些小鼠模型,研究人員可以更容易地在特定的細胞類型中實現多個基因敲除,更快地為疾病建模,從而研究多種生物學過程,包括癌癥、傷口愈合[28]、突觸傳遞[29]、晝夜節律[30]和T 細胞分化[31]等。

2.2 呼吸系統疾病治療中的應用 氧化應激可導致肺纖維化引起呼吸疾病[32]。通過CRISPR/Cas9 技術在細胞實驗中已證明低聚原花色素對非小細胞肺癌細胞 (A549)中過氧化氫誘導的氧化應激起到保護作用。實驗發現,低聚原花色素刺激的A549細胞中改變了Nrf2的表達。Nrf2是對氧化還原反應敏感的轉錄因子,可以引起其下游靶基因在轉錄水平和蛋白質水平上的變化。通過CRISPR/Cas9技術敲除Nrf2可以消除Nrf2與抗氧化反應元件ARE 的結合,從而消除了低聚原花色素介導的針對過氧化氫誘導的氧化應激的保護作用[33]。研究表明在A549細胞的抗氧化反應中低聚原花色素通過Nrf2-ARE 途徑起重要作用,這項研究為呼吸疾病的治療提供了理論依據[34]。

而且在臨床試驗中CRISPR/Cas9技術已經開始作為肺癌的干預手段。該試驗主要對PD-1 的功能進行了研究。PD-1只能在活化的T 細胞中表達,該基因可促進細胞的凋亡,是臨床上的一個免疫檢查點。當PD-1被敲除時會延長T 細胞的存活時間,這是因為T 細胞周期檢查點被抑制所導致,引起活化的T 細胞的存活時間延長。通過CRISPR/Cas9技術敲除PD-1基因后,血液中活化的具有免疫功能的T 細胞數量明顯增加,以此來抑制腫瘤生長[35]。此次試驗中,通過收集病患自體來源的T 細胞 (外周血液中),利用CRISPR/Cas9技術將PD-1基因敲除而喪失基因功能,再通過擴增篩選出已敲除PD-1的T 淋巴細胞,并將其分批回輸患者身體中,通過觀察臨床效果發現敲除PD-1基因對肺癌有抑制作用[36]。

2.3 AIDS和白血病治療中的應用 CRISPR/Cas9技術已廣泛應用于哺乳動物細胞基因組的體外編輯。盡管這種方法顯示出潛在的臨床實用性,并且已經開始進行臨床試驗以探索基于CRISPR 療法的安全性和可行性[37]。有研究表明,G 蛋白偶聯因子超家族成員CCR5基因是治療人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 (hu man i mmunodeficiency vir us type 1,HIV-1)感染的理想靶點,因為CCR5 缺失的血細胞對HIV-1進入具有很大的抗性[38]。2019 年,Xu 等[39]利用CRISPR/Cas9技術,在人體造血干細胞上進行CCR5基因編輯,實現了基因編輯后的成體造血干細胞在人體長期穩定的造血系統重建,初步證明了CRISPR/Cas9治療AIDS和白血病的可行性和在人體內的安全性。該研究將經CRISPR/Cas9編輯的CCR5敲除后的供者來源的CD34+成體造血干細胞移植到患有HIV-1感染和急性淋巴細胞白血病的患者中。在之后19個月的觀察中未發現基因編輯造成的脫靶及其他不良反應。之后為了進一步探索治療的有效性,對該患者短暫停止服用抗人類免疫缺陷病毒藥物。在此期間,CCR5基因編輯的T 細胞表現出一定程度抵御人類免疫缺陷病毒感染的能力。目前,雖然人們已經實現了CRISPR 編輯的造血干細胞的成功移植和長期植入,但淋巴細胞中CCR5破壞率僅約為5%,這表明還需要進一步進行研究。

2.4 其他疾病治療中的應用 基因編輯技術在治療其他多種疾病上也取得了重要的研究進展。2018 年,Long等[40]利用CRISPR/Cas9技術對杜氏肌營養不良癥患者機體的多能干細胞進行改造,使其產生了健康的心肌。2017 年,Liao等[41]報道利用CRISPR/Cas9在糖尿病小鼠體內募集轉錄激活復合物,實現順式表觀遺傳學修飾,介導基因轉錄活化的組蛋白修飾狀態,從而實現內源基因的激活。利用該體系可在肝臟內成功激活內源PDX1表達,使其分泌胰島素。Chen等[42]發現,酸敏感離子通道1 參與了前列腺癌細胞酸介導的信號通路,并且在前列腺癌細胞中表達升高,通過CRISPR/Cas9系統敲除酸敏感離子通道1可以顯著降低前列腺癌細胞的侵襲能力和去勢抵抗性。汪超甲等[43]利用CRISPR/Cas9表達載體敲除了在神經膠質瘤細胞中高表達的Pyk2,抑制了膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力,揭示了其在膠質瘤發生過程中的作用,為治療膠質瘤提供了理論基礎。Rubio等[44]利用CRISPR/Cas9系統在干細胞中針對神經系統疾病相關基因TSC2 與KCNQ2進行靶向滅活。TSC2與結節性腦硬化相關,KCNQ2與家族性先天性癲癇有關[45]。

3 問題與展望

CRISPR 系統介導的基因編輯技術出現以來,就在生物醫學等諸多領域產生了深遠的影響,但目前該技術在臨床治療應用中仍然存在一些問題,如有效性問題。我們知道基因編輯體系依賴于外源編輯酶或效應蛋白的表達,而蛋白分子量過大會很難通過病毒載體進行裝載以及人體內遞送,并且蛋白過表達引起的DNA/RNA 水平的脫靶效應、機體內的抗體中和外源編輯酶或效應蛋白都會導致基因編輯失敗。此外,還存在由外源蛋白表達引起的機體免疫反應及排斥的安全性問題。除了這些技術問題,倫理問題也不容忽視。2018年,有研究者跨過人類胚胎基因編輯技術的體外試驗階段,對2名志愿者在胚胎上進行基因編輯并植入母體,其中1名已經產下雙胞胎女嬰,由于這對雙胞胎的一個基因 (CCR5)經過修改,她們出生后即能天然抵抗人類免疫缺陷病毒[46]。這一事件一經宣布,立即引起了世界的關注,科學家們對此事更多的是質疑和負面評價。

隨著科學家研究的不斷深入探索,基因編輯技術正在走向成熟。基因編輯技術已經在基礎科研和臨床應用中取得了重大突破與進展,具有極大的研究潛力和廣闊的應用前景,將會使我們對疾病機制的理解、對生物基因網絡的認識更加清楚。盡管目前對于基因治療還有許多技術難題需要解決,但我們可以相信隨著人類基因表達調控機制的闡明,以及轉基因方法的完善,基因編輯技術會在臨床疾病治療中發揮其不可替代的價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突