機械響應生物材料在骨損傷再生康復中的應用

孫富華，張 馳

1.西南醫科大學附屬醫院康復醫學科（瀘州646000）；2.西南醫科大學康復醫學系（瀘州 646000）

由腫瘤、創傷、炎癥或衰老造成的骨損傷修復是臨床仍未完全解決的問題。一般情況下，骨缺損可根據其位置劃分為長骨和脊柱缺損、頜面部和顱面缺損。在自然愈合過程中，骨再生部位不會形成瘢痕組織。然而，骨損傷的復雜性增加了愈合延遲和不愈合的風險，且不當的治療過程，可能引起多種并發癥，如血管形成不良，以及形成新骨的祖細胞數量不足，導致自然愈合過程的失敗[1]。在所有骨損傷的病例中，有10%的病例骨愈合不充分導致骨不連或節段性缺損[2-3]。目前促進骨損傷后的功能恢復的方法主要有兩種：再生醫學（如利用細胞、藥物和生物活性分子、生物材料）和康復（如運動訓練、機械刺激）。

治療骨損傷的金標準依然是骨移植，包括自體和同種異體骨移植。但自體移植物受限于獲取的骨體積、可能引起的并發癥（如獲取部位病變、局部血腫）和植入骨的重塑等[4-5]，所以自體骨移植還不能完全滿足臨床需求。同種異體骨移植因宿主骨組織的整合性和血管化較差，同樣限制了其臨床應用[6-7]。另外，牽張成骨是一種比較成熟的治療技術，但該技術耗時長、疼痛感較強，治療不規范還有可能導致愈合不良和再骨折[8-10]。所以，臨床治療中亟需一種可持續、更有效的治療技術。骨組織工程作為最有潛力的再生修復技術，可將細胞、功能因子、生物材料相互配伍開發多種骨組織工程支架，用以促進損傷骨的愈合[11-13]。根據組織工程的發展階段，可將開發的骨組織支架分為以下三類：①單純生物材料支架；②負載活性因子（藥物、蛋白）的支架；③裝載細胞的支架。其中單純生物材料支架已有部分正處于臨床試驗的不同階段（I，II或III期），有些甚至已經進入臨床。此外，第二類負載活性因子支架仍處于臨床前階段。

臨床中骨損傷進行再生修復后常配合康復治療，如運動訓練、電刺激、磁療以及超聲等[14]，但單獨的再生醫學和康復治療的作用是獨立的，難以產生協同作用，尚不能有效促進骨損傷的功能恢復[14-15]。因此，再生醫學和康復的理論、技術、方法和治療理念要相互結合，才能從骨損傷治療一開始就介入，參與骨再生和功能重建。研究發現骨損傷修復過程中的骨穩態和重塑受外部機械刺激的調控，也是外部機械力轉化為細胞內部生化信號的作用過程[14-15]，而骨組織工程修復損傷骨則是通過支架材料與細胞、組織相互作用實現的。常用的“智能”材料中，機械響應生物材料利用鍵的形成/斷裂、結構的變化或納米顆粒的響應能力，可將康復治療中的機械刺激（運動訓練、超聲）轉化為支架與成骨細胞及間充質干細胞（MSC）前體的界面調控，從而實現再生醫學和康復治療的聯合作用，修復受損骨的組織結構，實現生理功能的恢復[16]。

因此，本文綜述了當前骨損傷的再生醫學方法和康復方法，并進一步討論了機械響應生物材料作為再生醫學和康復的“橋梁”在促進骨再生和功能重建中的應用。機械響應生物材料可作為藥物和細胞的載體以治療骨損傷，還可與機械刺激配合，增強骨的可塑性，從而促進骨功能的重建。

1 再生醫學

1.1 細胞

骨損傷的自然愈合過程很大程度上受所處機械環境的影響。機械不穩定的長骨損傷是通過形成中間軟骨痂而愈合的，隨后重新塑造骨的結構和形狀。最初的軟骨痂主要由骨膜釋放的細胞形成，并保持骨的穩定態，并伴隨血管向骨內生長以及軟骨重塑。然后，從骨膜和骨髓中招募的祖細胞分化成成骨細胞，礦化沉積形成新骨。而在機械穩定的顱骨損傷環境中，受損骨主要通過直接骨化愈合，骨膜、骨髓和硬腦膜提供的細胞均有助于缺損骨的愈合。因此，可通過骨損傷的類型來決定修復所用細胞的來源、介質、刺激因子和3D環境。

1.1.1骨髓間充質干細胞（BMSCs）BMSCs 作為一種從骨髓基質中獲取的異質細胞群，在骨損傷愈合過程中具有較強的成骨能力[17-18]。將BMSCs 注射到穩定的骨折中，有助于直接骨化[19-20]。研究表明，在骨折愈合過程中，將BMSCs 注射于損傷部位，并不能促進軟骨生成，但有助于新骨重塑以及減弱炎癥反應[21]。

1.1.2脂肪來源干細胞（ASCs）ASCs 廣泛存在于多種類型的脂肪組織中，在體外的增長速度比BMSCs 更快，擴增時基因更穩定[22]。Cowan 等[23]用裝載ASCs的支架修復小鼠臨界尺寸的顱骨缺損，結果顯示膜內成骨效果顯著，由植入細胞形成的新骨占再生骨量的84%～99%。在脊柱融合方面，含ASCs 的支架展現出更好的效果，炎癥細胞浸潤減少，融合程度更高。Mesimaki 等[24]將自體ASCs 接種于負載生長因子BMP-2的β-TCP支架中，體外培養8周后，形成了一種具有成熟骨結構和血管的組織工程支架，將其移植至缺損部位，并配合康復治療，骨缺損愈合良好。

1.1.3骨膜來源細胞（PDSCs）骨膜作為覆蓋在骨外表面的薄膜組織，包括與周圍的軟纖維組織和肌肉組織相鄰的外纖維層（70 mm）和內層形成層（30 mm）。內層形成層直接與外骨皮質相連，具有高度的血管化特點，是具有獨特組織構建能力的骨-軟骨祖細胞的宿主。在自然骨骼發育和穩態中，形成層細胞產生成骨細胞，與破骨細胞同步參與骨的生長和重塑。在骨損傷修復過程中，來自骨膜的祖細胞通過快速增殖和成軟骨/成骨分化，促進骨損傷的愈合。臨床中，骨膜組織可以通過手術從患者身上獲得，再將其固定在損傷骨表面[25]。但自體骨膜的來源有限且需要二次手術，有研究利用特定的培養條件在體外成功培育出PDSCs，其具有分化成軟骨或成骨的能力[26]。Gonzalez-Gil等[27]利用不同來源細胞結合生物材料修復大鼠臨界骨缺損，追蹤細胞植入物的修復效果，結果顯示，與BMSCs 相比，PDSCs 存活率更高，而且同樣可促進骨再生。

1.2 生物活性因子

復雜的骨修復過程涉及到多種生長因子。根據以往的研究可以將這些活性生物分子分為三類:①重組生長因子；②細胞外基質蛋白衍生肽；③功能小分子。這些生物活性因子可直接或間接地影響骨量，調控骨再生過程。

1.2.1生長因子 目前已經在臨床獲批準的生長因子有三種：BMP-2、BMP-7 和PDGF。這些生長因子通過與其各自的受體相互作用，直接作用于骨祖細胞，這些受體在干細胞中啟動生化信號，促使骨形成。Bouyer等[28]使用臨床級別的PLGA作為BMP-2的納米載體，在大鼠股骨骨缺損模型中，通過調節BMP-2 的劑量可以控制新形成骨的體積，并通過釋放的BMP-2加速骨修復的過程。但BMP-2介導的骨修復具有劑量依賴性，高劑量可導致骨溶解。Cecchi等[29]將BMP-7 與I 型膠原相結合用于頑固性長骨不連和脊柱手術，研究顯示復合支架的療效良好和安全性較高，而且BMP-7可與支架結合來觸發長骨的修復。PDGF常用于治療不同類型關節炎以及足和踝關節融合術。通過作用于PDGF受體，刺激細胞的募集和增殖，包括間充質干細胞。還可通過促進血管內皮細胞、周細胞和平滑肌細胞的生長，促進損傷部位新血管的形成，并有助于骨修復。Covell 等[30]評估了20例踝關節前融合板與自體移植物重組人蛋白衍生生長因子（rhPDGF-BB）聯合使用的早期患者的臨床和影像學結果，配合負重康復訓練，融合率高達90%，且與傷口愈合相關的并發癥較少。

1.2.2細胞外基質蛋白衍生肽 B2A（B2A2-K-NS）是一種生物活性合成多域肽，可增強脊柱融合。研究發現B2A能增強BMP-2的成骨活性，在骨關節炎模型中可以誘導軟骨分化，促進受損軟骨的修復[31]。P-15 是一種由膠原蛋白（骨細胞外基質的主要蛋白）衍生的具有15 種氨基酸的多肽，在成骨細胞附著和生長中發揮作用，并促進間充質干細胞的分化。Sherman 等[32]在一項前瞻性隨機研究中發現，牛來源的羥基磷灰石與合成的15 個氨基酸殘基（ABM/P-15）復合材料在促進腰椎體間融合方面與取自髂骨的自體骨的療效基本一致。

1.2.3功能小分子 甲狀旁腺素在調節鈣磷酸鹽代謝中起核心作用，可增強wnt-β catenin 通路，這也是骨形成關鍵通路。Arrighi 等[33]使用基于人類甲狀旁腺激素（PTH（1e34））的活性片段，與谷氨酰胺轉移酶底物結合，負載于纖維蛋白載體中形成復合支架，在母羊的股骨和肱骨缺損實驗中顯示，使用PTH 纖維蛋白基質形成的骨形成具有劑量依賴性，揭示骨傳導和骨誘導的骨愈合機制。NELL-1是一種分泌型骨誘導蛋白，其表達控制骨形成量，并促進軟骨再生。無論在體內還是體外，它都能誘導周細胞增殖并具有促血管生成的作用。Meyers 等[34]用成年或老年小鼠骨髓間充質干細胞分別過表達NELL-1810和NELL-1570，通過檢測細胞形態、增殖和基因表達，顯示出NELL-1570 的促增殖作用是具有年齡依賴性的，在成年小鼠中有明顯的誘導作用。

1.3 生物材料

骨組織工程利用細胞、生物活性因子和生物材料三種關鍵元素來構建骨組織微環境，誘導新骨的形成。開發新型的生物材料能夠使組織支架更有效地模擬骨基質的層次特征，并從分子組成到納米/微尺度模擬天然骨的生化和物理特征。

1.3.1優化力學性能 骨支架材料的力學性能越接近自然骨組織，就越有可能避免對周圍結構的不良影響。臨床中，金屬植入物周圍的骨組織，如髖關節假體，由于應力遮擋[35]，隨著時間的推移會退化。這是由于植入后機械載荷的重新分配，力學強度更高的金屬植入體承受了大部分的機械應力，而周圍的骨組織因沒有機械刺激而被吸收，抑制了融合和再生潛能。同樣，如果骨支架材料的性能比周圍組織弱，周圍組織會進行力學補償，這可能會阻礙骨再生，且可能對周圍組織造成損傷。因此，優化骨支架材料的力學性能至關重要。

1.3.2調控孔隙結構 骨支架材料的孔隙結構如能模擬天然骨結構，可為骨細胞的生長和再生骨組織提供類似天然骨的體內環境。骨支架材料中的結構優化包括宏觀和微觀孔隙率、孔隙大小和孔隙連通性的優化，以模擬松質骨或皮質骨的孔隙率。Zheng 等[36]使用微型計算機斷層掃描（CT）對人體頭顱樣本進行掃描，然后進行三維重建，構建類似骨小梁的內部結構的生物材料支架，結果顯示，這種結構更有利于細胞的生長以及促進骨再生。Rustom等[37]在同一支架中的不同區域構建了不同的孔隙結構，體內實驗顯示一定的孔隙結構有利于豬下頜骨缺損內的骨生長。

1.3.3設計降解性能 理想的骨支架材料首先必須作為一個臨時的支架，然后逐漸被新骨取代，以恢復形態和功能，直到新生長的骨具有力學能力。骨支架材料的可降解性與孔隙率有關，因為孔隙增加的表面積有利于離子化合物在骨支架材料中的溶解。增加的孔表面也有利于骨支架材料和周圍的細胞和分子之間的相互作用。研究顯示，植入材料中硅（Si）或鎂（Mg）的摻入可以改善骨支架材料的促骨再生能力。當植入大鼠股骨時，與不添加硅和鎂的β-TCP支架相比，添加Si和Mg離子的β-TCP支架顯示骨形成和血管生成增加[38]。

1.3.4優化表面形貌 骨支架材料表面性質是內源性成骨細胞附著和新骨組織在骨支架材料表面生長的重要因素。通過表面處理可在支架上構建促進骨再生的表面。例如，鈦和鉭由于其優異的力學性能，目前被應用于骨和牙的修復，但其生物活性較低，導致骨結合不良。因此，需要進行表面處理以增強支架與周圍組織的粘附性和穩定性。Braem等[39]在鈦植入體表面構建直徑小于10 mm 的孔隙，與光滑的表面相比，更有利于骨組織的附著以及骨融合。優化的粗糙表面可以增加種植體的存活/持久性，改善種植體的功能，并減少額外手術的痛苦。

1.3.5“骨免疫微環境”骨再生生物材料的成功取決于生物材料與體內局部骨微環境的整合程度，以及如何調節關鍵的骨愈合過程。宿主免疫系統對生物材料植入的反應是生物材料在骨組織工程中應用的關鍵。隨著生物材料研究的進步，生物材料的設計方法已經從傳統的免疫友好型轉向了免疫重編程型生物材料。目前主要的方法大致分為化學方法的生物材料表面修飾、物理修飾和生物分子功能化。對具有不同功能基團、密度或表面電荷的材料進行化學修飾，以改善生物材料的物理性質（如形貌和剛度），可有效地用于調節骨形成細胞和免疫細胞的功能。Bang 等[40]將骨髓源性巨噬細胞植入兩種不同類型的鈦表面，噴砂/酸蝕鈦和親水噴砂/酸蝕鈦。結果顯示所有破骨細胞標志物如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、破骨相關免疫球蛋白樣受體（OSCAR）、MFATc1和c-Fos在親水表面均下調。此外，Mg2+修飾表面可以抑制破骨細胞的形成。生物分子的表面修飾，無論是作為表面修飾形式還是作為遞送分子，都可介導骨組織的免疫反應。Downes 等[41]通過靜電紡絲技術制得一種新型聚合物（聚乙烯基膦酸-共丙烯酸（PVPA-AA））纖維，并將成骨細胞（人成骨細胞，HOBs）和破骨細胞（人破骨前體細胞）在這些纖維上培養14天，成功誘導分化，PVPA-AA增加成骨細胞OPG的表達，從而誘導HOBs成熟和礦化，同時減少活的破骨細胞數量。

2 康復醫學

2.1 機械刺激

骨損傷的康復治療方法包括多種物理刺激，比如電刺激、熱刺激和機械刺激。其中，機械刺激對再生修復的影響最為明顯。骨是一種機械敏感組織，機械力對骨結構發育和重塑的影響在骨康復中早已被公認。特別是，機械刺激可以通過機械轉導影響細胞行為，這對維持骨組織穩態至關重要。此外，天然骨具有壓電特性，可以將機械力轉化為電信號，從而促進骨生長。

Glatt 等[42]采用大鼠股骨缺損模型，研究了支架剛度對BMP-2 治療的臨界尺寸、骨干、節段缺損愈合的影響。結果證實了BMP-2治療后大骨缺損的愈合受到局部力學環境的強烈影響，而且還顯示通過改變剛度提供反向動力，可以促進愈合過程。進一步的研究表明，當反向動力作用時，較低劑量的BMP-2可以成功修復大段骨缺損[43]。反向動力對亞臨界尺寸的骨缺損的自發愈合具有相同的刺激作用。

超聲波療法是康復治療中施加機械刺激的重要方法之一，在臨床中，對損傷骨施加超聲刺激可以刺激細胞的生長，并將機械信號轉化為分子機制，從而促進骨再生，使脛骨、橈骨和肩胛骨的臨床愈合時間減少30%～38%，并可刺激未開裂的過渡性骨損傷進行重塑[14]。

2.2 其他治療

自20世紀50年代發現骨的生物電特性以來，電刺激療法已被廣泛用于臨床，作為促進骨損傷愈合和增強脊柱融合的補充手段。最近的體外研究表明，電刺激可促進骨細胞在刺激部位的遷移、增殖和分化。電刺激成骨的一種可能機制是通過電刺激激活電壓門控的Ca2+通道上調細胞內鈣濃度，進而通過鈣調素途徑調節成骨[44]。另外，脈沖電磁場（EMF）的磁刺激療法一直被用于補充骨愈合。Naito 等[45]將燒結的釹磁鐵植入到兔股骨缺損模型中，與無磁性的植入物相比，靜態磁場可顯著促進新骨的再生。

3 機械響應生物材料：橋接再生與康復

機械刺激和生物支架聯合作用有利于高度礦化骨的形成。對裝載細胞的復合支架施加循環機械刺激，每天15 分鐘，持續時間為7、14 或21 天。結果顯示，機械刺激可以雙重調節MSCs的炎癥反應和成骨分化，促進了體外巨噬細胞M2極化和體內骨再生[46]。此外，外部機械刺激可以與骨支架的物理特性發揮協同作用。Subramony等[47]研究了納米纖維表面結構和機械刺激對間充質干細胞分化的作用，當受到拉伸載荷時，定向或非定向納米纖維對干細胞分化產生不同的影響，支架排列和優化的機械刺激，足以驅動間充質干細胞分化，而不需要額外的化學刺激。因此，具有力學響應的支架在不同方向的外力作用下會產生不同的細胞響應，通過外部力學刺激配合再生修復的支架材料是解決臨床骨損傷最有潛力的方法。

超聲作為重要的康復治療手段，利用其深層組織穿透能力及機械刺激作用可用于遠程觸發按需藥物遞送。Kearney等[48]基于離子交聯藻酸鹽基質開發了機械響應納米復合水凝膠，其中負載了包裹BMP-2 的金納米顆粒。復合水凝膠在脈沖超聲刺激可加速納米顆粒釋放。研究結果還顯示生長因子結合的納米顆粒不僅在包封和超聲刺激后保持了其生物活性，而且與被動擴散相比，機械刺激的復合水凝膠顯著增強了成骨活性。此外，具有機械響應的納米顆粒還可包埋在具有不同超聲敏感性的膠囊中，以連續遞送納米顆粒。在特定的超聲刺激下，程序式釋放出功能成分，特別是在骨骼中，這種按需及時輸送生物活性物質對于骨再生康復至關重要。

除了外部力學因素外，最近的研究也表明細胞基質相互作用所產生的內力對MSCs 功能也發揮著關鍵作用。支架可以通過其剛度或其他力學特性被動地產生內力，產生力學信號可以促進細胞分化[49]。Chatterjee 等[50]在10 kPa、300 kPa 的壓縮模量范圍內檢測了聚乙二醇水凝膠中成骨細胞的分化。結果表明，較硬的水凝膠可促進成骨。雖然已知成骨細胞對剛度和基底地形的反應與細胞機械轉導有關，但其確切機制仍在研究中。

4 總結與展望

綜上所述，無論是支架外部作用還是支架內部產生的機械刺激，都可以作為調節骨再生的關鍵因素。機械響應生物材料通過整合再生醫學方法，在配合機械刺激下可促進骨再生和功能重建，戰略性地將再生醫學和康復結合起來。

在骨損傷修復中，目前還未有使用機械刺激配合機械響應生物材料的臨床研究。機械響應生物材料本身的特性是臨床轉化的主要問題，如機械響應性和隨時間的穩定性、支架降解以及免疫反應等都需要在體內環境進一步的驗證。雖然初始響應性很重要，但機械響應生物材料必須在足夠長的時間內保持足夠敏感的響應性能，尤其是當生物材料降解時，其響應穩定性就變得更重要。對于可降解生物材料，理想的降解率要與組織再生率相匹配。支架降解過快或過慢都會影響骨的再生和康復。鑒于目前骨損傷恢復治療通常需要幾個月的時間，機械響應材料可能需要合適的降解時間以及更好的響應穩定性，以實現長期機械刺激，促進骨再生。

除了對生物材料的要求外，在體內結合生物材料和機械刺激時還存在其他的轉化挑戰，包括確定機械刺激的類型、位置和強度等參數，以與機械響應生物材料協同。目前機械響應生物材料向臨床轉化的一個關鍵就是機械響應生物材料的臨床前研究，而且復雜的組成難以獲得臨床監管批準。目前外部施加機械刺激（超聲）的治療作用已經得到臨床驗證，但單獨的機械響應材料或聯合刺激對骨再生的作用效果和機制仍未闡明。

未來的體外和體內研究需要闡明機械響應生物材料本身的作用，并確定機械刺激與生物材料是否真正可以協同作用，實現真正的骨再生康復。