上皮細胞-間質細胞轉分化在慢性阻塞性肺疾病氣道重塑中的作用

鄒義敏

浙江省呼吸疾病診治及研究重點實驗室 浙江大學醫學院附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科,杭州 310009

COPD 的特點為持續性氣流受限,其主要病理基礎是氣道重塑和肺實質毀損。氣道重塑的本質是細胞外基質合成與降解失衡所導致的組織纖維化形成,其主要效應細胞是成纖維細胞[1]。成纖維細胞來源可能有3個途徑：組織局部成纖維細胞增殖、血液循環纖維細胞的募集、上皮細胞-間質細胞轉分化 （epithelial-mesenchymal transition,EMT）途徑[2]。EMT 這一現象最早是在觀察雞胚胎發育過程中發現的,由Hay[3]于20世紀70年代后期正式提出。EMT 不僅在胚胎發育,而且在惡性腫瘤轉移、損傷修復、器官纖維化中起重要的作用。EMT 是否參與了COPD 發病以及其具體作用機制如何,本文就此作一綜述。

1 氣道上皮與COPD

氣道上皮組織表面由纖毛細胞、杯狀細胞、Clara細胞和基底細胞組成；纖毛細胞從氣管到遠端呼吸性細支氣管均可見,隨著氣道直徑的減小,纖毛細胞的高度由假復層柱狀細胞向單層柱狀細胞遞減,這些氣道上皮細胞通過細胞間上皮緊密連接形成有效的物理屏障,抵御病原體和有害物質的侵襲[4]。重要的是,氣道上皮也是啟動肺部先天免疫反應的第一道防線[5]。

煙草煙霧等有害物質長期暴露可損傷氣道上皮組織導致COPD 發生。COPD 病理改變包括肺氣腫、慢性支氣管炎和肺血管改變[6]。大氣道病變可見纖毛倒伏、上皮鱗狀化生、黏液腺肥大、網狀基底膜破裂、黏膜下基質增多、氣道平滑肌增生肥厚等。黏液分泌過多和黏液細胞增生是大氣道病變的特征,而炎癥和纖維化是小氣道病變最重要的病理改變。COPD 的氣流受限是由外周而非中央氣道管腔大小決定的,正常人肺內小氣道 （直徑＜2 mm）氣流阻力微乎其微,但對于COPD 患者來說小氣道卻是氣流阻塞的最主要部位。反復的氣道損傷-修復循環導致氣道重塑,這種病變早于肺氣腫形成[7]；相對于肺氣腫而言,小氣道重塑是COPD 氣流受限的主要原因[8]。氣道重塑纖維沉積過多的主要效應細胞是成纖維細胞,其來源仍未完全知曉。

2 EMT

2.1 EMT 的概念 上皮細胞在各種誘發因素作用下,經過多方面生化改變,失去與基底膜連接的細胞極性等上皮表型,而獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型,這一生物過程稱為EMT。即細胞從具有緊密連接、立方形、極性和缺乏動力的上皮細胞表型,轉化為細胞間作用松散、梭形的、無極性、活動力強和能產生細胞外基質的間質細胞表型。EMT 在胚胎發育、腫瘤轉移、損傷修復、器官纖維化中起重要作用[9]。

最新研究指出,體內EMT 的顯著特征從上皮狀態到間充質狀態的轉變通常是不完全的,導致細胞停留在同時保留上皮和間充質特征的中間狀態。重要的是,這些不同的中間狀態具體取決于所在的生物學環境[10]。因此,EMT并不是全或無的二元過程,而應該是一個連續性的動態過程[11]。

2.2 EMT 分型

2.2.1 EMT 亞型1 該類型發生在胚胎發育形成的正常生理過程中。中胚層原始間充質細胞通過EMT 的方式形成,隨后,中胚層的間充質細胞通過 “間充質細胞-上皮細胞轉分化”的方式,產生次級上皮細胞,最后形成中胚層和內胚層結構中分化發育成熟的上皮細胞。此類型只完成胚胎器官發育,而不會形成纖維化。

2.2.2 EMT 亞型2 該類型發生在成熟組織細胞被持續炎癥等刺激因素所導致的損傷修復過程中,由上皮細胞或內皮細胞直接轉分化為成纖維細胞,最終結果是導致纖維化。

2.2.3 EMT 亞型3 該類型發生在上皮來源腫瘤細胞轉移過程中。在原腫塊處第一步由上皮性腫瘤細胞轉分化為轉移性瘤細胞,接著遷移到遠處形成繼發性腫瘤結節。此類型不是導致纖維化,而是轉分化成轉移性瘤細胞,導致腫瘤侵襲和轉移[11]。

2.3 EMT 生物標志物 EMT 的發生過程除了形態學改變明顯之外,也會發生較多生化改變。上皮組織具有明顯的極性,細胞間結合緊密,其連接方式有緊密連接、橋粒連接和縫隙連接,由閉鎖蛋白、閉合蛋白、細胞角蛋白等構成,E-cadherin為其主要成分[12]。因此,使用的上皮細胞標志物主要有E-cadherin、細胞角蛋白等。間質細胞標志物常用的有波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白1（fibroblast-specific protein-1,FSP1）、α-平滑肌肌動蛋白等。波形蛋白是存在于大多數間質細胞內的中間絲,與微管及肌動蛋白一起組成細胞骨架。細胞外基質蛋白包括纖連蛋白、層黏連蛋白、I型膠原蛋白等,也可用作EMT 間質細胞標志物[13]。

3 EMT與COPD氣道重塑

損傷后的肺穩態取決于肺組織上皮組織完整性的有效恢復,病理性損傷-修復循環導致纖維化在許多肺部疾病中被關注,包括肺間質纖維化、COPD、哮喘、囊性纖維化、肺移植閉塞性細支氣管炎等[14]。目前認為,分泌細胞外基質的成纖維細胞池數量的增加可能有3種來源：組織局部成纖維細胞增殖、血液循環成纖維干細胞的募集、EMT 途徑。EMT 在肺發育和肺癌中的作用被廣泛接受,但是EMT 在氣道纖維化疾病中的存在和作用不是很清楚,可能與缺乏對細胞環境可塑性和異質性的認識有關[15]。

較多體外實驗研究結果證實氣道上皮細胞具備發生EMT 的潛力。轉化生長因子β （transforming growth factor-β,TGF-β）是一種有效的EMT 誘導劑,早在十年前,Kuroishi等[16]首先報道小鼠原代氣道上皮細胞在TGF-β1 作用下可發生EMT,實驗采用TGF-β1 刺激原代培養的小鼠氣道上皮細胞,14 d后檢測發現上皮細胞表型標志物表達明顯減少,而α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白等間質細胞表型標志物表達明顯增多,并且免疫熒光染色提示上皮細胞標志物和間質細胞標志物共表達現象。Doerner等[17]接著在人支氣管上皮細胞系和人原代上皮細胞也證實可誘導氣道上皮細胞發生EMT。眾所周知,吸煙和生物燃料煙霧暴露是COPD 重要的危險因素。最近有研究采用煙草煙霧提取物可誘導不吸煙者、吸煙者和COPD 患者的原代支氣管上皮細胞發生EMT,其機制可能是通過活性氧自由基的產生從而促進TGF-β1的表達,同時降低環磷酸腺苷的水平[18]。通過人支氣管上皮細胞系 （16HBE）,使用尼古丁、木材煙霧凝集物等刺激細胞72 h后,也觀察到上皮細胞形態向成纖維細胞樣改變,上皮細胞表型標志物與間質細胞表型標志物共表達,呈現EMT 特征性改變[19-20]。

目前,EMT 在COPD 氣道重塑中作用的體內研究并不多。在大氣道方面,Sohal等[21-22]通過支氣管鏡活檢大氣道上皮組織,進行EMT 標志物免疫組織化學染色,對比分析吸煙COPD 患者、既往吸煙COPD 患者、吸煙肺功能正常者、不吸煙肺功能正常者4組之間的網狀基底膜破裂程度和EMT 標志物染色情況,結果顯示COPD 患者和吸煙者的氣道上皮基底層細胞處可見到FSP1 和波形蛋白雙染陽性并伴有表皮生長因子受體表達增長的細胞；部分細胞出現細胞角蛋白與FSP1 共染色,這些強烈提示上皮細胞通過網狀基底膜破裂處遷移進入上皮下固有層,分化為成纖維細胞樣間質細胞,產生細胞外基質導致氣道重塑,首次揭示體內EMT 參與COPD 患者的氣道重塑的證據。與Sohal等[21]的研究選取大氣道組織標本不同,有文獻報道在吸煙COPD 患者小氣道組織標本也觀察到了EMT 參與氣道重塑的依據[18,23]。Gohy等[24]通過手術切除肺組織標本,在小氣道和大氣道活檢中均證實COPD 患者的傳導氣道管壁組織上都存在EMT 特征,并首次發現COPD 氣道上皮EMT 改變與氣道上皮下纖維沉積和氣流受限呈正相關。大鼠被暴露于生物燃料煙霧7個月來制作生物燃料相關COPD 動物模型,通過免疫組織化學染色發現上皮下成纖維細胞數增加明顯,并在小氣道上皮組織發現ECadherin和FSP1共染色的細胞,證實EMT 參與了生物燃料煙霧暴露相關氣道重塑的發生[20]。

盡管體內、體外研究均提供了一些證據提示EMT 與COPD 的氣道重塑密切相關,但EMT 在體內應該是一個動態完整的過程,而目前的研究提供的僅僅是其中的部分片段,需要探索更好的能夠動態觀察的實驗方法,來全程追蹤EMT 在體內發生、進展的動態過程以及具體誘發機制。

4 EMT信號通路

各EMT 亞型無論是在胚胎發生期間還是在諸如癌癥等發病機制中,能被多種生長因子、細胞因子、激素和細胞外某些因素所誘導和調節,包括TGF-β、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子等,其中,TGF-β作為一個強力、主要的誘發因子研究最多,越來越多的研究證實Smad經典通路和多條非Smad通路 （包括絲裂原活化蛋白激酶通路、Rho樣GTP酶信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶通路）共同參與了TGF-β 誘導的EMT,引起三大轉錄因子家族（Snail家族、ZEB家族、b HLH 家族）表達改變,這些轉錄因子最后導致上皮標志性蛋白的基因表達受抑制,而間質細胞的基因表達被激活[25]。這些靶基因中一部分是Ecadherin、閉鎖蛋白、緊密連接蛋白等的抑制因子,以及纖連蛋白、N 鈣黏蛋白等的活化因子；還有一些作為EMT過程的信號分子,聯系不同的信號通路,發揮重要的調節作用。此外,Shh信號通路、Wnt/β-catenin和Notch信號通路等也參與EMT 發生,這些通路之間似乎相互串聯,并取決于受影響的特定上皮或內皮細胞類型,從而對EMT起一定的調節作用[26]。

5 EMT研究的臨床意義

COPD 是一種發病率、致殘率和病死率均高的慢性氣道疾病,目前尚無有效延緩肺功能下降的治療藥物,迫切需要深入研究COPD 的發病機制,尋找新的治療靶點。目前的大多數研究都集中在疾病終末期,而COPD 患者幾乎一半以上的小氣道在疾病早期階段已被破壞,導致肺功能下降。EMT 在COPD 早期患者的大、小氣道中都存在,與肺功能的下降顯著相關,其發病可能通過最初的上皮細胞損傷激活而觸發,要改變疾病軌跡,關鍵是要了解吸煙者早期損傷上皮細胞的機制,EMT 可能在COPD 氣道重塑的發生、發展中發揮著重要作用[11,27]。雖然目前臨床上還沒有EMT 特異性的治療藥物,但新出現的證據表明,一些目前使用的藥物可能會影響EMT 的過程。一項隨機對照實驗研究顯示,與安慰劑相比,吸入丙酸氟替卡松6個月以上可抑制COPD 患者大氣道中EMT 相關的部分改變,但似乎無法完全消除,這是第一次報道吸入激素在COPD中的抗EMT 作用研究[28]。矽肺動物模型研究發現,吡非尼酮可降低肺組織中TGF-β1和Smad2/3的表達,進而抑制EMT 過程和肺纖維化,其作用可能與TGF-β1/Smad信號通路有關[29]。Wang等[23]研究發現尿激酶型纖溶酶原激活劑受體在COPD 患者小氣道上皮中的表達增加,使用Sh RNA 靶向沉默尿激酶型纖溶酶原激活劑受體可以抑制煙草煙霧誘導的人小氣道上皮細胞的EMT 發生。盡管看到了新的希望,但是目前為止,能阻斷COPD 氣道上皮發生EMT 的治療手段的相關研究報道還很少。

綜上所述,氣道上皮是呼吸道抵御外界刺激損傷的第一道防線,反復的損傷-修復循環導致氣道重塑,而EMT可能是COPD 發病及進展的重要機制,已有初步研究表明拮抗EMT 信號通路可能有助于減輕COPD 氣道重塑。今后需要進一步明確EMT 參與COPD 氣道重塑的作用機制,尋找更有效的治療靶點,來改善COPD 患者的肺功能和預后。

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