新型冠狀病毒基因組、蛋白質及疫苗的研究進展

張杰 唐華平

1濰坊醫學院臨床醫學院 261053；2青島市市立醫院東院呼吸與危重癥醫學科266071

據WHO統計，截至2021年3月28日，全球累計確診新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)126 372 442例，累計死亡2 769 696例[1]。當前，全球范圍內COVID-19的確診病例持續上升，造成了前所未有的醫療和社會經濟危機，解開新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Co V-2)生物學信息是及時有效抗擊這種大流行的基礎。目前已經確認SARS-Co V-2屬于β冠狀病毒，在全基因組水平上與冠狀病毒序列相似程度高[2-3]。SARS-Co V-2的氨基酸序列與冠狀病毒也有相似之處，通過對其編碼蛋白的進一步研究，為防治工作奠定一定的基礎。目前，一些有效的抗病毒候選藥物和疫苗正在接受緊急研究，為早日戰勝疫情帶來曙光。

1 基因組的相關研究

SARS-Co V-2是一種基因組大小約為30 kb的包膜、陽性、單鏈的RNA病毒，隸屬于冠狀病毒科的sarbecovirus亞屬，在sarbecovirus亞屬內形成了一個獨立的亞類[4-6]。約30 kb大小的基因組多達14個開放閱讀框(open reading frame，ORF)[7]，基因組G+C含量為38%，基因組包含2個側翼未翻譯區和1個編碼多蛋白的長ORF，基因組的排列順序為：5'非翻譯區(untranslated regions，UTR)、復制酶編碼區(ORF1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR和幾個未經鑒定的非結構ORF，但是缺乏β冠狀病毒特有的血凝素酯酶基因[4-5，8]。其中5'UTR、ORF1ab、S基因、E基因、M基因、N基因和3'UTR的基因預測長度分別為：265、21 291、3 822、228、669、1 260和229nt[9]。有關研究發現SARS-Co V-2的E基因、M基因、N基因與相關冠狀病毒的序列同源性高(均大于90%)，最高的是E基因(98.7%)；但是S基因與相關冠狀病毒的序列同源性最低，只有75%左右，顯示出了較大差異[3]。有關學者還在S基因中發現了一些重組的證據，但沒有證據表明重組促進了SARS-Co V-2的出現[2，10]。Kim等[11]采用了兩種互補的測序技術，繪制了SARSCo V-2轉錄組的高分辨率圖，全面認識了SARS-Co V-2的生命周期和致病性。采用最新生物信息學方法和更大規模的數據，從蛇基因組中2%的所有蛋白質編碼基因擴展到脊椎動物基因組中10%的所有蛋白質編碼基因并進行比較，發現SARS-Co V-2與蛇使用的相對同義密碼子的差異不是最小的，反駁了蛇可作為中間宿主的說法，從側面反映了在缺乏全面的數據或后續實驗驗證的情況下，應謹慎避免對數據作出過度解釋[12]。研究發現蝙蝠、穿山甲和貓科類冠狀病毒與SARS-Co V-2基因序列最為密切，這表明需要持續的監測和預警野生動物和家養動物中存在的病毒庫，對于找到中間宿主及切斷傳播途徑具有一定的意義[13]。

SARS-Co V-2是單鏈RNA病毒，每個復制周期都會出現突變，從27個SARS-Co V-2分離株中分離出6個基因型，表明已經發生突變，這種變異值得注意，今后要警惕任何快速突變導致疫情的再次暴發[14]。有學者對86個SARS-Co V-2的基因組進行了遺傳分析，發現了編碼區和非編碼區的許多突變和缺失，從而為SARS-Co V-2遺傳多樣性和快速進化提供了證據[15]。Pachetti等[16]用GISAID數據庫分析了220個基因組序列，發現了8個新的突變，而且在不同地區突變的位置及模式不同，這表明SARSCo V-2正在不斷進化。COVID-19病死率可能因地理區域的不同而不同，因此要反映某些突變的存在可能與不同的病死率相關還需要進一步的研究來證實。此外，Kim等[17]在SARS-Co V-2基因組中確定了767個同義突變和1 352個非同義突變。一種新的SARS-Co V-2病毒分離株在刺突蛋白中攜帶一個點突變(D614G)，并在傳染性上迅速超過其他分離株，進一步研究表明Spike蛋白中的D614G突變增強了病毒在人類細胞中的轉導，在多個細胞系中，攜帶D614G突變的SARS-Co V-2轉導細胞的效率是野生型的8倍[18]。病毒突變的生物學特征可能為致病機制提供寶貴的見解。分析SARS-Co V-2的基因，對于其起源、發病機制、治療及預防具有重大意義。

2 蛋白質的相關研究

SARS-Co V-2的基因組可編碼9 860個氨基酸[4]，其在氨基酸水平上與嚴重急性呼吸綜合征病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-Co V)有差異，存在380個氨基酸替換，相關輔助蛋白質的氨基酸個數也不相等，這可能導致SARS-Co V-2的功能和致病性與SARS-Co V不同[19]。SARS-Co V-2包含16種病毒復制和發病所需的非結構蛋白(nonstructural protein，NSP)、4種結構蛋白[棘突蛋白(S)、病毒包膜(E)、基質蛋白(M)、核蛋白(N)]以及9種其他輔助因子[6]。5種重要蛋白的氨基酸長度分別為7 096個氨基酸(ORF1ab)、1 273個氨基酸(S蛋白)、75個氨基酸(E蛋白)、222個氨基酸(M蛋白)和419個氨基酸(N蛋白)[13，20]。

NSP2內有關結構域的穩定突變可能會導致高傳染性，NSP3的不穩定突變可能是區別于SARS-Co V的重要標志[21]。NSP7b和NSP8可以影響宿主的免疫應答信號，其在進化過程中的功能變化可能影響感染人的能力[22]。NSP可以形成一種復制酶/轉錄酶復合物，其由多種酶組成，包括NSP3、NSP13和NSP10/NSP16等[7]。

S蛋白對病毒亞型及疫苗應答具有重要作用[6]。其能識別宿主細胞受體催化膜融合，在相關酶的作用下，被分成S1和S2亞單位。S1包含一個信號肽，其受體結合區(receptor binding domain，RBD)與受體結合；S2高度保守，包含融合肽和細胞質結構域，與人類SARS-Co V具有99%的同源性。因此，抗S2的廣譜抗病毒肽有治療病毒的發展前景[4]。最近的一項研究發現SARS-Co V-2進入宿主細胞需要絲氨酸蛋白酶(TMPRSS2)啟動S蛋白，抑制TMPRSS2可阻止感染宿主細胞，這可作為一個抑制病毒傳播的新治療靶點[23]。有學者利用SARS-Co V S蛋白生成多克隆抗體，可以有效阻止SARS-Co V-2感染宿主細胞，為疫苗和病毒進入抑制劑的設計提供了藍圖[24-25]。SARSCo V-2與SARS-Co V S蛋白的RBD相似程度高，進一步研究發現二者都是利用人血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受 體 進 入 宿 主 細 胞[3，9，23]。Monteil等[26]發現人類重組可溶性ACE2可以阻斷SARSCo V-2早期階段的感染，為治療和預防提供了新方向，也間接反映出了SARS-Co V-2通過人ACE2受體進入宿主細胞。β冠狀病毒家族中E蛋白、M蛋白是高度保守的蛋白質，而輔助蛋白似乎有更嚴格的進化限制[27]。另外SARSCo V-2病毒主蛋白酶是一種關鍵的輔酶，在介導病毒復制和轉錄中起著關鍵作用，可以作為病毒的一個有吸引力的藥物靶點或新藥先導[28]。這些發現有助于進一步了解SARS-Co V-2發病機制，分析SARS-Co V-2與其他冠狀病毒蛋白的差異，為抗病毒治療做鋪墊。

3 疫苗的相關研究

雖然疫苗的研發無法影響第一波大流行，卻在預防感染和第二次大流行上具有重大戰略意義。疫苗種類主要包括經典的滅活疫苗、減毒疫苗、蛋白質亞單位和病毒樣顆粒疫苗、基于病毒載體的疫苗以及新的基于DNA和m RNA的疫苗等，每種疫苗都有其自身的優缺點，所有疫苗都在同時開發[6，29-30]。有學者運用免疫原性預測模型鑒定出了具有高免疫原性的SARS-Co V-2多肽，通過肌肉注射或皮下注射將其傳遞給宿主以激發免疫反應是疫苗的研發一個重要方向[31-33]。隨后有關學者發現冠狀病毒3CL水解酶是病毒蛋白水解酶成熟所必需的，利用3CL水解酶結合佐劑增強免疫應答，通過短肽連接體相互連接，可以構建多表位多肽疫苗[34]。回顧抗SARS-Co V RBD單克隆抗體和體外中和SARS-Co V病毒的研究發現，有開發針對SARS-Co V-2的異源SARS-Co V RBD疫苗的可能[35-36]。在動物實驗中，滅活的SARS-Co V-2候選疫苗和DNA疫苗可為小鼠、非人類靈長類動物提供保護，以抵抗SARSCo V-2的攻擊[37-39]。有趣的是，一種新型的誘騙性細胞疫苗利用表達SARS-Co V-2 S蛋白的非復制細胞作為免疫原性抗原的載體和呈現者，被宿主免疫系統識別，從而產生有效的保護性免疫應答，采用這一創新策略可以開發一種新型疫苗來預防SARS-Co V-2感染[40]。有關學者認為理想情況下，可以開發出一種能夠預防多種冠狀病毒的疫苗，即“泛冠狀病毒”疫苗。這種疫苗不僅可以預防目前已知的冠狀病毒，而且可以預防那些未來出現的新的冠狀病毒[41]。

2020年3月，美國開始了一種新型的mRNA疫苗(m RNA-1273)Ⅰ期臨床試驗[42]，希望可以在預防SARSCo V-2中發揮作用。DNA和mRNA疫苗更容易設計并很快進入臨床試驗，但是在疫苗進入臨床之前還需要科研人員驗證其安全性[43]。在驗證疫苗安全性上，Zhu等[44]通過人體試驗發現重組腺病毒5型載體疫苗是相對安全、可耐受和具有免疫原性的，其具有較大的發展潛力。隨后我國在603名成年志愿者中開展了腺病毒5型載體疫苗的Ⅱ期隨機雙盲試驗，在單次免疫后大多數接受者有了相當大的體液和細胞免疫反應，說明該疫苗是安全有效的[45]。目前已報道了數百種SARS-Co V-2候選疫苗，其中有許多處于Ⅱ期臨床試驗，有些已經進入Ⅲ期臨床試驗。在一項有關牛津大學開發的載體疫苗Ch Ad Ox1隨機對照的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，所有1 077名參與者均誘導出了針對SARS-CoV-2的中和抗體，表明該疫苗不僅是有效的，而且具備一定的安全性。目前，美國輝瑞公司和德國Bio NTech公司的m RNA疫苗BNT162b2正在美國、英國和加拿大等地區進行接種。美國莫德納公司的m RNA-1273、俄羅斯衛生部研制的Sputnik V和英國阿斯利康公司的AZD1222在其Ⅲ期試驗中也取得了巨大成功，正在考慮緊急使用[46]。我國被認為是SARS-Co V-2疫苗研發的世界領先國家之一。截至目前，附條件批準上市的有3款利用非洲綠猴腎細胞研發的滅活疫苗、1款利用5型腺病毒研發的腺病毒載體疫苗及獲批緊急使用的1款利用我國倉鼠卵巢細胞研發的重組亞單位疫苗。我國的疫情防控取得了舉世矚目的成績，然而病毒基因組的突變在限制疫苗的使用壽命方面起著重要作用，相關疫苗還在試驗階段，需要國際合作應對控制COVID-19疫情的重大挑戰。

4 展望

通過有限的治療和預防措施，抗擊來歷不明、生物學特性神秘的SARS-Co V-2，是一項具有挑戰性的任務。對于控制COVID-19疫情，研究SARS-Co V2的基因組和蛋白質結構是必不可少的。所有這些知識將為疫苗和抗病毒治療的發展鋪平道路。相信在我們的共同努力下會早日戰勝疫情。

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