外泌體源性miRNA在眼部疾病中的研究進展

朱 妍，姚牧笛，孟祥瑞，蔣 沁

0引言

外泌體被定義為直徑30～200nm的細胞外泌性囊泡，它可由多種細胞產生并釋放入細胞外空間，廣泛存在于尿液、血液、唾液等生物體液中[1]。外泌體內含有蛋白質、脂質及mRNA、miRNA、circRNA等多種核酸，通過傳遞功能性物質調節炎癥反應、免疫應答、組織修復等重要病理生理過程[2]。其中，miRNA是一類長度約為22nt的短鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA的非翻譯區或開放閱讀框結合，介導轉錄后基因沉默[3]。miRNA可于外泌體中穩定存在，隨外泌體循環并被鄰近或遠處的細胞攝取，參與受體細胞的增殖、分化、遷移等活動，調控疾病的發生和進展[4-6]。

鑒于囊泡的可運輸性，外泌體源性miRNA的作用受到了極大的關注。近年來的研究證實外泌體源性miRNA與諸多眼部疾病的發生發展有密切的聯系，是極具潛力的診斷標志物及新型治療靶點。本文就外泌體源性miRNA的基本概況及其在眼部疾病中的相關研究進行系統綜述。

1外泌體源性miRNA的基本概況

1.1外泌體源性miRNA的發現及研究現狀miRNA是短鏈非編碼RNA的主要亞型，通過序列特異性方式結合靶RNA，在轉錄后水平抑制基因表達，參與機體的各種生命活動，因此一直是研究的熱點[3]。1983年，Pan等[7]首次發現了外泌體，此后大量研究證實，外泌體及其內容物在細胞通訊中發揮至關重要的作用[8]。2007年，Valadi等[9]首先證實了miRNA存在于外泌體中，并可被輸送到受體細胞內。后又有研究發現，外泌體可保護miRNA免受體液中RNA酶的降解，使其穩定存在[10]。自此，外泌體源性miRNA引起了廣泛關注，各類研究層出不窮。目前發現的外泌體源性特異性miRNA已高達2 838種[11]，其研究范圍涵蓋免疫、腫瘤、神經等各個領域，對多種疾病的診斷、預后評估、治療都具有不可估量的價值[12-14]。

1.2外泌體源性miRNA的分選機制在外泌體所包含的全部RNA中，成熟miRNA的比例高達41.7%[15]。2014年，Goldie等[16]證實外泌體中miRNA的比例高于其母細胞。此后多項研究表明，母細胞可能具有一種或幾種特殊的機制，將特定種類的miRNA引導入外泌體。盡管仍需更深一步的探索，但目前學者們已經發現了四種可能的途徑。(1)神經鞘磷脂酶2(nSMase2)依賴途徑：Kosaka等[17]發現過表達nSMase2會使外泌體中miRNA的數量增多，而抑制nSMase2表達則能起到相反的作用。(2)miRNA基序及SUMO化核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)依賴途徑：Villarroya-Beltri等[18]研究表明，SUMO化hnRNPA2B1可識別miRNA序列3’端的GGAG基序，使特定的miRNA進入外泌體。(3)miRNA 3’末端序列依賴途徑：Koppers-Lalic等[19]發現，尿苷化內源性miRNA的3’末端主要出現在B細胞或尿液來源的外泌體中，而腺苷化內源性miRNA的3’末端主要出現在B細胞中。(4)miRNA誘導沉默復合物(miRISC)相關途徑：Guduric-Fuchs等[20]的研究證實，敲除miRISC主要成分之一AGO2可減少HEK293T細胞來源的外泌體中優先輸出的miRNA的類型或豐度。綜上所述，miRNA的特異性序列對其與外泌體的結合至關重要，某些酶或蛋白質也能以一種獨立于miRNA序列的方式指導外泌體源性miRNA的分選。

1.3外泌體源性miRNA的功能及應用外泌體源性miRNA可循環至鄰近或遠處的細胞，并進入受體細胞發揮作用。其功能大致可分為兩種：一種是常規功能，即負向調控基因表達；另一種是作為配體與Toll樣受體結合并激活免疫細胞，但此功能僅存在于部分外泌體源性miRNA[21]。

外泌體源性miRNA有潛力作為非侵入性生物標志物以指示疾病狀態。一方面，外泌體的膜結構可減少體液中RNA酶對miRNA的降解作用，增強miRNA分子的穩定性，使其在樣本中保存更長時間[6]。另一方面，外泌體存在于人體大多數體液中，且外泌體miRNA的數量和組成在生理及病理情況下存在明顯差異。諸多研究已經對不同樣本的外泌體源性miRNA進行了分析，明確其可用于臨床診斷和預后評估[22-23]。此外，外泌體良好的生物相容性及穿越生物屏障的能力保證了內容物的完整性和活性[24]。而除內源性miRNA外，外源性miRNA及其他小RNA也能以相似的分子機制被外泌體轉運。如人腫瘤病毒可利用外泌體作為傳遞載體，將外源性miRNA轉移到其他未感染的細胞中[25]。這一重要發現也為目前備受關注的基因治療提供了新的途徑。

2外泌體源性miRNA在眼部疾病中的相關研究

在眼睛的不同部位，如視網膜、角膜、房水、玻璃體及淚液中，都有外泌體的存在，且多種眼科疾病的發生、發展、轉歸均與外泌體有關[26]。近年來的研究表明，外泌體對眼科疾病的調控作用很大程度上依賴于外泌體源性miRNA的種類與功能。

2.1角膜疾病近年來的研究證實，外泌體源性miRNA對修復角膜損傷，抑制角膜纖維化具有極其重要的作用。角膜是重要的屈光介質，而損傷、感染和手術引起的傷口愈合過程會降低角膜的透明度，引起視力下降。Shojaati等[27]的研究顯示間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)來源的外泌體可阻斷角膜瘢痕形成，恢復瘢痕角膜的透明度，但當外泌體源性miRNA減少時，該作用減弱。這揭示了外泌體源性miRNA在角膜透明組織再生過程中的重要作用。機制研究證實，在基質創傷愈合過程中，角膜細胞分化為成纖維細胞和肌成纖維細胞細胞，導致細胞外基質沉積，角膜細胞晶狀體蛋白表達減少，最終造成角膜瘢痕形成，透明度降低[28]。因此，抑制角膜基質細胞的分化是治療的關鍵。Shen等[29]發現，脂肪干細胞來源外泌體中的miR-19a下調了HIPK2的表達，導致促纖維化蛋白如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅲ型膠原、基質金屬蛋白酶9和纖維連接蛋白減少，抑制了角膜細胞向肌成纖維細胞的分化，表明外泌體源性miRNA在修復受損角膜基質及治療角膜纖維化中具有巨大潛力。此外，全身性疾病例如糖尿病等也會造成角膜的損傷。Leszczynska等[30]對正常及糖尿病患者角膜緣間質細胞來源的外泌體進行了miRNA分析，確定了10個差異表達的miRNA。其中，miR-184已被證實參與維持角膜上皮穩態，而miR-200b-3p及miR-200c-3p已被證明在抑制生長和活動方面發揮重要作用，很可能導致了糖尿病病程中上皮的遷移和愈合能力減弱，GO分析結果也支持外泌體源性miRNA與糖尿病角膜病變密切相關。以上結果表明，外泌體源性miRNA很可能對角膜緣微環境有重要的調節作用，或可作為糖尿病角膜病變的新型治療工具。

2.2視網膜疾病外泌體源性miRNA的調節作用在糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)中也扮演重要角色。DR是致盲的主要原因之一。在疾病進展過程中，高糖水平可影響視網膜神經血管單元，導致視網膜炎癥，新生血管生成及神經退行性病變等病理過程，最終造成纖維化[31]。Zhang等[31]發現，外泌體源性miR-126能夠靶向HMGB1通路，降低視網膜內皮細胞中NLRP3炎癥小體的活性，從而抑制高糖誘導的視網膜炎癥。更重要的是，異種MSC分泌的外泌體也能夠有效減輕大鼠的視網膜炎癥。Kamalden等[32]的研究則顯示在高糖環境下，胰腺β細胞產生的miR-15a通過外泌體被運輸至視網膜微血管床，靶向Akt3誘導氧化應激，引起細胞凋亡，表明其可在DR的進展中發揮一定作用。內皮間質轉化參與DR的病理性纖維化過程。Gu等[33]證實在高糖刺激下，視網膜色素上皮細胞分泌的外泌體通過轉移miR-202-5p作用于TGF/Smad信號通路，調控HUVEC細胞的生長，遷移和成管，抑制內皮間質轉化過程。

外泌體源性miRNA還有望為年齡相關性視網膜病變提供新的診斷及治療策略。年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是老年人群視力喪失主要的原因之一。在其發病機制中，視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞發揮關鍵調節作用。它可表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，誘導脈絡膜新生血管生成[34]。Yoon等[35]的研究顯示，Raji外泌體富含miR-155，誘導ARPE-19細胞中VEGF-A的表達上調，且經Raji外泌體處理后的ARPE-19細胞條件培養基增強了內皮細胞成管能力。將miR-155抑制劑導入Raji外泌體后則逆轉了這些作用，表明外泌體源性miRNA的傳遞可調節細胞微環境，促進新生血管生成。高半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，HHcy)可破壞血-視網膜屏障，標志ARMD等多種視網膜疾病的發生發展[36]。Elmasry等[37]發現HHcy改變了RPE細胞來源外泌體中miRNA的含量，同時確定了88個差異表達的miRNA。此外，針對ARMD及其他年齡相關性視網膜病變的危險因素，Morris等[38]鑒定了外泌體中表達水平隨年齡變化的miRNA，發現外泌體介導的miR-21轉移可使p53信號通路下游的基因表達上調，從而調節老化視網膜小膠質細胞的功能。以上結果表明，外泌體源性miRNA或可作為ARMD及其他年齡相關性視網膜退行性病變診斷的生物標志物和治療靶點。

此外，外泌體源性miRNA還參與調節多種視網膜疾病中光感受器進行性退化的病理過程。Bian等[39]研究發現，小鼠及人神經前體細胞源性外泌體均含有一組miRNA，能夠靶向活化小膠質細胞中的TNF-α、IL-1β及COX-2，使炎癥性信號通路明顯受到抑制，從而減少光感受器的凋亡。Xu等[40]則發現外泌體可將miR-24-3p轉移至光感受器，并通過下調IRE1α的蛋白水平，降低光感受器凋亡率，從而緩解缺氧誘導的視功能減退。

2.3青光眼及視神經損傷隨著對外泌體研究的不斷深入，人們發現外泌體源性miRNA有望成為青光眼及視神經損傷的新型治療靶標。青光眼及視神經損傷可導致視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)丟失，造成失明。目前的治療方法主要用于減緩疾病的發展，不能從根本上逆轉神經網絡的損傷。干細胞移植及基因療法雖已取得一定的進展，但其限制條件多，實施不易，臨床普及困難。因此，外泌體源性miRNA的發現及其在青光眼和視神經損傷中的研究進展具有重要的臨床意義。Liu等[41]分離檢測發現，miR-182在高眼壓性青光眼患者房水及人小梁網衍生的外泌體中高表達，揭示了其通過調節房水動力學及眼壓而在原發性開角型青光眼發病機制中的潛在作用。Mead等[42]也證實骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)來源的外泌體可將其內含物運輸至視網膜內部，并通過miRNA依賴機制產生神經保護及軸突生成作用。此后Mead等[43]挑選了6個在BMSC小細胞外囊泡中差異表達的miRNA，組合后用腺相關病毒作為載體注射至視神經擠壓傷大鼠玻璃體腔內。結果顯示在5種miRNA組合中，有3種可使大鼠視網膜神經纖維層厚度較PBS對照組及空載體組顯著增加，證實了它們對神經節細胞及其軸突的保護作用。而Pan等[44]則在研究中發現臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UMSC)外泌體雖然可促進視神經夾傷后RGC的存活，但并無軸突生成作用。鑒于BMSC外泌體與UMSC外泌體中miRNA的組成不同，他們推測，是外泌體源性miRNA的不同種類和含量導致了不同的效應。

2.4其他眼部疾病在其他眼部疾病，如腫瘤、玻璃體疾病、晶狀體疾病及近視中外泌體源性miRNA也很可能發揮一定作用。但目前這些領域相關的研究較少，故仍需進一步探索。

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)于成年人中多見，惡性程度高。臨床對其診斷大多依靠眼底鏡、超聲、FFA等檢查，但易受屈光介質混濁，眼內出血等因素的影響。Ragusa等[45]發現，UM患者血清與玻璃體液中的miRNA差異無統計學意義，但原癌性轉錄因子miR-146a在玻璃體液、玻璃體外泌體、血清及血清外泌體中皆上調，表明致癌外泌體可能通過腫瘤血管進入血液，傳遞功能性miRNA，影響腫瘤的發展，有望作為UM的新型非侵入性診斷標志物及治療靶點。

外泌體源性miRNA在晶狀體及玻璃體疾病領域的研究也取得了一定成果。Gao等[46]的研究顯示與年齡相關性白內障相比，糖尿病白內障組的外泌體中有433個差異表達的miRNA，其中miR-551b升高最顯著。同時發現miR-551b下調了CRYAA的表達，增加人晶狀體上皮細胞的凋亡并減少其活力，證實外泌體源性miRNA的異常表達可能是糖尿病性白內障潛在的發病機制。RPE細胞的上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的重要病理過程[47]。Zhang等[48]發現miR-543在發生EMT的ARPE-19細胞外泌體中高表達。同時，將miR-543模擬物轉染入正常ARPE-19細胞外泌體并作用于受體ARPE-19細胞后，受體細胞miR-543水平增高，α-SMA及纖維結合蛋白表達增多，E-鈣黏蛋白表達減少。這些結果表明外泌體源性miRNA在EMT的誘導中起著關鍵作用。

此外，外泌體源性miRNA在近視的發展中也具有重要的作用。Chen等[49]通過對近視組及對照組房水樣本進行外泌體miRNA測序及分析，確定了5個近視特異性miRNA(has-miR-582-3p、has-miR-17-5p、has-miR-885-3p、has-miR-19b-3p、has-miR-450b-5p)及1個近視缺失miRNA(has-miR-378a-5p)，并確定了這些miRNA的靶基因；雖仍需通過完善的體內外實驗及臨床研究進行驗證，但該成果為近視的研究提供了新的方向。

3總結與展望

外泌體源性miRNA的發現為眼部疾病的研究提供了新的方向。外泌體可由眼部多種細胞釋放且分布廣泛，獲取容易，且其脂質雙層膜結構可顯著增加miRNA的穩定性。在生理及病理狀態下，外泌體源性miRNA的種類及豐度不同。此外，外泌體還具有較好的生物相容性及穿越生物屏障的能力。這些優勢提升了外泌體源性miRNA應用于疾病診斷及治療的可行性。然而，外泌體源性miRNA在眼科疾病中的研究尚處于起步階段，在葡萄膜炎、眼眶炎性疾病等亞方向尚無重要研究成果。特異性miRNA的分選、裝載、轉運及對受體細胞的調控機制仍需進一步探究。隨著研究的不斷深入，外泌體源性miRNA有望成為診斷和監測眼部疾病的新指標，甚至可能用于基因治療。未來值得探索的研究方向包括：能否在合適的樣本中選取一種或一組標準化的特異性外泌體源性miRNA，以提高對特定疾病的診斷敏感性及準確性；能否構建更詳盡的miRNA-靶基因網絡，揭示外泌體源性miRNA在眼部疾病發生發展中的分子機制；能否尋求成熟的技術，利用外泌體作為轉運平臺，將特定miRNA或其拮抗劑注入玻璃體腔或前房，精確調控靶基因的表達，治療內眼疾病。