超極化激活的環核苷酸門控陽離子通道在心血管系統中作用的研究進展▲

尹 琳 黃從新

(武漢大學人民醫院心內科，武漢大學心血管病研究所，心血管病湖北省重點實驗室，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：1727415874@qq.com)

【提要】 超極化激活的環核苷酸門控陽離子(HCN)通道為超極化激活的陽離子通道，受電壓和環核苷酸雙重調節。近期科學家利用低溫電磁儀探索了HCN通道的某些特殊結構，為研究相關的離子通道特性提供了理論依據。HCN通道及其亞型在心臟中的分布具有一定的種屬特異性，病理狀態下各亞型的異常分布常常引起各類心律失常，另外HCN基因突變亦參與病態竇房結的形成。誘導多能干細胞作為一種新興的具有潛在發展前景的干細胞，將為研究HCN基因突變及其參與心臟離子通道病變的病理生理和分子學變化提供良好的模型，且有利于針對HCN通道的特異性藥物和生物起搏器的研發。

超極化激活的環核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN)通道主要有以下特點:超極化激活、鈉鉀離子混合通道、電壓及環核苷酸雙重調節。目前，研究表明HCN基因參與心血管系統的心率調節和神經系統中神經元興奮的調節。現就HCN通道在心血管系統中作用的研究進展進行綜述。

1 HCN通道的結構

HCN通道包含4種亞型(HCN1、HCN2、HCN3和HCN4)，每個通道是由4個子單位圍繞中央孔隙排列形成的1個四聚體，其中每個子單位內主要包括S1～S6的跨膜核心區域、位于胞質內的氨基端與羧基端3個部分。另外，羧基末端包含有環核苷酸結合的結構域(cyclic nucleotide-binding domain,CNBD)。最近，有學者利用低溫電磁儀探索了HCN通道中的某些特殊結構，進一步闡釋了該通道的某些基本特性[1-3]：(1)不同于經典構象的4個陽離子結合位點，HCN通道中編碼的鉀離子選擇性過濾器為非經典構象，僅包含兩個陽離子結合位點；另外，該鉀離子選擇性過濾器被酪氨酸所包圍，僅允許兩個鉀離子通過。當HCN通道僅結合1個鉀離子時，鈉離子可輕易地采用非結合的方式通過該通道，進而產生內向電流。正常情況下，HCN通道的鈉鉀離子通透性的比值在1 ∶5～1 ∶3之間，且其通透比取決于細胞外的鉀離子濃度。(2)跨膜蛋白S4、S5、S6呈螺旋狀排列，其中S4螺旋的長度尤其明顯，可延伸至胞質中的CNBD段。靜息情況下，上述結構使得去極化電壓傳感器及門控通道均處于封閉狀態；當細胞膜超極化時，電壓驅動S4螺旋向下移位，打破了跨膜蛋白之間的穩定結構，因此S6螺旋自發地發生旋轉，離子門控通道被打開。而Gross等[4]利用線性方程理論，更詳細地闡述了環磷酸腺苷(cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate,cAMP)結合如何在長距離上機械耦合以促進依賴電壓的HCN通道的開放。(3)HCN通道中存在著一段高度保守的結構域，命名為HCND(HCN-domain)[5]。HCND段夾在電壓感應區域和CNBD之間，并通過分子內部相互作用在電壓感應區域和CNBD之間搭建起1個機械連續體，即電壓感應區域和CNBD之間變構信息的相互傳遞可以直接通過HCND進行，從而有利于平衡電壓及cAMP對HCN通道的雙重調控。

2 HCN在心血管系統中的表達

竇房結中HCN及其各分型的轉錄水平在各種屬之間具有較為明顯的差異：在小鼠、兔子和人類的竇房結中以HCN4為主，其次為HCN1，HCN2表達量少，幾乎檢測不到HCN3[6-9]；但在犬科動物的竇房結中，HCN4與HCN2占主導地位；更令人驚訝的是在整個大鼠的生命周期中，HCN2在竇房結中的轉錄水平占據絕對的優勢，其相對含量約為HCN4的8倍，幾乎檢測不到HCN1與HCN3的表達[10-11]。

但是，各種屬心臟的總體HCN表達具有很多的相似點：首先，HCN總mRNA在心臟中的分布較為一致，竇房結最高，其次依次為房室結、浦肯野纖維，而在心室與心房中表達量較少，以心房最甚[6]；其次，成年后HCN總轉錄水平隨年齡增長逐漸下降，但各房室中的比例基本上保持穩定[11]；再次，4種HCN在竇房結外的分布在各種屬之間的差異性不明顯，其中心房均以HCN1為主，而HCN2則主要出現于心室，其轉錄水平為HCN4的5～13倍，房室結和浦肯野纖維以HCN4與HCN1為主，且兩者轉錄水平相近[6]；最后，HCN3目前未在出生后任何種屬的心臟中被檢測到，有相關研究報告其僅在小鼠早期胚胎發育階段(孕齡9.5～15.5 d)的靜脈竇區域可被檢測到[7]。

在病理情況下心臟中HCN的分布發生明顯改變。例如，充血性心力衰竭時竇房結中HCN的mRNA和蛋白質水平均降低，但在右心房中HCN4的表達上調至基線水平的2倍[10]。另外，在病態竇房結合并房性心動過速的犬模型中，竇房結中的HCN2、HCN4表達均明顯降低，伴If電流振幅與頻率降低，但其房性心動過速可能是由于HCN4與HCN2在心房中表達增加所引起的[12]。還有研究表明，心力衰竭時心室肌中HCN2的表達急劇上升，其能增加β受體阻滯劑的副作用，進而導致致死性心律失常[13]。

3 心血管系統中HCN通道的藥理學研究

3.1 特效的減慢心率制劑 特效的減慢心率制劑(specific bradycardic agent,SBA)包括烯丙尼定、扎替雷定、西洛雷定、伊伐布雷定和ZD7288，其主要作用機制是通過抑制If電流，進而降低舒張期自動去極化，最終達到減慢心率的目的[14]。這些藥物的一個重要特點是，其僅影響HCN通道的電流，而不調節該通道的電壓依賴性。烯丙尼定和扎替雷定由于其嚴重的副作用，目前均已停產。

伊伐布雷定是目前唯一還流通于商業市場上的SBA，相較于其他SBA而言，其效應不作用于神經系統，因此無明顯相關的不良反應。新近研究表明，對于β受體阻滯劑不能控制病情的急性心力衰竭患者，聯合使用伊伐布雷定至出院，并維持使用至出院后180 d，能明顯減慢患者的心率，而不影響β受體阻滯劑的療效[15]。另有研究顯示，伊伐布雷定不僅能降低心臟移植術患者的心率，維持其左心室射血分數，還可提高5年生存率[16]。臨床大樣本研究顯示，盡管伊伐布雷定能維持心肌梗死患者的左心室收縮功能，降低心率，但進一步的長期隨訪卻提示其可增加心血管不良事件的發生率，如心動過緩、新發房顫等[17-19]。因此，根據歐洲心臟協會制定的指南，伊伐布雷定被認定為收縮性心力衰竭和慢性穩定型心絞痛患者的B類治療藥物，其適用于最大β受體阻滯劑劑量治療下心率仍>70次/min的患者[20-21]。

3.2 選擇性HCN亞型抑制劑 近期發現的HCN亞型特異性抑制劑，如EC18、MEL57A，分別有選擇性地作用于HCN4通道和HCN1通道。其中，EC18能特異性靶向作用于豬竇房結細胞中的HCN4通道，而MEL57A對神經系統中的HCN1通道表現出了顯著的抑制效應[22-23]。另外，在狗的浦肯野纖維細胞中，EC18能減少If電流去極化的振幅與斜率，而MEL57A則對HCN4無明顯作用[24]。

3.3 CNBD別構調節劑 Akimoto等[25]利用冷凍電子顯微鏡技術展示了在apo(即未結合cAMP狀態下)的HCN4通道內CNBD的結構。他們進一步說明了HCN通道自身的平衡狀態與cAMP相結合狀態下的結構變化及動力學變化，其證實了帶有apo HCN4 CNBD結構的二聚體可別構調節HCN4通道與cAMP之間的結合，因此認為這種別構調節劑可作為HCN通道的新型靶向抑制劑。

目前的研究表明，伊伐布雷定應用于心血管疾病時，仍可與其他離子通道相互作用而產生某些副作用。與靶向離子通道的藥物相比，靶向CNBD的別構調節劑可以提供更具有選擇特異性的HCN調節。事實上，藥物靶向變構位點可能表現出較高的選擇性。目前，對于這種別構調節劑作用的認識還處于初步假設階段，仍有待進一步研究與開發。

4 HCN基因突變與病態竇房結綜合征

目前，許多研究表明HCN4基因的突變參與病態竇房結綜合征的形成。例如，Ishikawa等[26]檢測到人類HCN4基因中編碼S4電壓門控通道的區域存在突變位點(R393H)，與心臟鈉通道基因突變引起的病態竇房結不同，攜帶該突變的患者心電圖不表現為心動過緩、房室傳導阻滯、心房撲動等，外源性起搏器的植入率亦不高，其主要的臨床表現為心房顫動和左心室致密化不全。HCN4基因G1097W突變體現為房室傳導阻滯及反射性竇性心動過速，而D553N位點的錯義突變導致HCN4通道蛋白不能被轉運至細胞膜，心電圖以長QT間期與尖端扭轉性室速為主要表現[27-28]。

體外動物實驗亦證實HCN4參與胚胎期竇房結的發育與出生后竇性心律的維持。例如，心臟特異性敲除HCN4基因的胚胎期小鼠是不能存活的，其大約在孕齡9.5～11.5 d的階段出現胚胎致死性，而該階段正是正常竇房結胚胎期的發育時間，因此可認為該胚胎致死性可能是由于竇房結未發育而造成的[29-30]。另外，在成年小鼠中，心臟特異性或全身性敲除HCN4基因或其中的某個表達位點(如573X位點)后，可檢測到If電流振幅減少，體表心電圖表現為反復地心臟停搏或竇性心動過緩[9,31-32]。

5 HCN通道應用于生物起搏

生物起搏就是體外利用基因重組的技術誘導起搏樣細胞的形成，從而替代原來受損的起搏細胞，以使得病態竇房結綜合征患者重新獲得能夠滿足正常生命活動所需的心率。由于HCN4通道在心臟竇房結的心率調節中發揮著重要的作用，因此近些年來HCN通道被廣泛應用于生物起搏的實驗研究當中。由于HCN2通道比HCN4通道更容易激活，因此研究者傾向于選擇HCN2作為生物起搏開發的起搏基因。前期的研究是通過直接將攜帶HCN2的腺病毒直接轉染至犬的左心房或左束支，結果顯示該注射位點確實能在一定程度上產生異位起搏點，但其起搏心率不高，未曾達到基礎心率狀態[33]。但有學者發現，HCN4活性與心肌細胞的鈣調節有關，If電流升高會導致鈣離子穩態失調，使得心室肌細胞過表達HCN4，從而引起細胞死亡和心臟重塑，最終導致心臟擴張和心臟功能受損[34]。

為了減少腺病毒直接作用于心臟細胞引起的免疫原性及HCN基因對心肌細胞的直接損傷作用，有學者將攜帶HCN2或者HCN4的腺病毒結合相關竇房結轉錄因子如TBX3，直接在體外感染各種類型的干細胞誘導起搏樣細胞，如大鼠骨髓間充質干細胞、小鼠胚胎干細胞和人類誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)，結果顯示，相較于單純轉染TBX3而言，TBX3聯合HCN4或HCN2能明顯增加體外誘導的起搏樣細胞的搏動頻率[35-37]。

6 小結與展望

隨著科學技術的日新月異及學科之間的交叉融合，研究者對HCN4通道蛋白的結構功能與分子機制有了進一步的認識。盡管伊伐布雷定已經被作為收縮性心力衰竭和慢性穩定型心絞痛患者的B類治療藥物，但特異性靶向HCN通道某些區域的別構調節劑將有望成為新型HCN通道抑制劑。

人類胚胎干細胞和早期心臟祖細胞高轉錄HCN4與HCN1的mRNA，在這些細胞中均可檢測到If電流的存在[38-39]。近幾年，iPSC憑借著來源簡單、近乎全項分化潛能、低免疫原性等優勢，逐漸占據了干細胞基礎研究的主導市場。目前，已在小鼠來源的多能干細胞和人 iPSC來源的心肌細胞中檢測到HCN通道的表達[40]。盡管iPSC的功能及特性尚未被完全了解，但其已成為一種新興的具有潛在發展前景的干細胞。心力衰竭和心律失常等病理狀態下HCN通道在心臟中異常分布亦為心源性猝死的病因之一，因此我們可利用干細胞建立相關病理模型來深入進行機制學探討及藥理學開發。此外，許多研究表明HCN基因突變為病態竇房結綜合征的病因學之一，利用干細胞全面探討HCN通道及其突變的病理生理學變化和分子學變化過程，將有利于生物起搏器的進一步研發。