精子DNA碎片檢測在輔助生殖中的研究進展

陳云斌

（柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州，545006）

近年來，隨著生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，我國不孕癥患病率也隨之上升，患病率為10%～15%，而因男性所致不孕高達40%，其中10%正常男性與20%～25%不育男性均伴較為嚴重的精子DNA 損害[1]。精子DNA 碎片（SDF）檢測是常規(guī)精液分析中的一項重要補充，其是檢測精子功能的重要指標。相關(guān)研究顯示，SDF 與氧化應(yīng)激損傷、精子異常、精子凋亡等具有密切相關(guān)的聯(lián)系[2]。SDF 指數(shù)（DFI）主要是在多種不利條件下，引起DNA 斷裂的精子占全部精子的百分比，其在評估精子DNA 完整性中具有一定的積極作用。相關(guān)研究顯示，SDF 檢測水平對輔助生殖技術(shù)(ART)治療方式產(chǎn)生一定的影響，可指導(dǎo)ART 治療，但仍存在一定爭議，分析原因可能與SDF 閾值相關(guān)[3]。

1 SDF 檢測方式

1.1 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(SCSA）

SCSA 為DNA 碎片檢測的金標準，其主要原理為正常精子DNA緊密結(jié)合具有抗酸性，以此保持雙鏈穩(wěn)定，而遭受損傷的精子DNA 較為疏散，在酸作用下可逐漸形成單鏈，與雙鏈DNA、吖啶橙相結(jié)合，可呈現(xiàn)出綠色熒光，而與單鏈DNA 相結(jié)合，可呈現(xiàn)出紅色熒光，最終經(jīng)過流式細胞儀準確、快速以及客觀的對SDF進行測定，具有敏感、結(jié)果穩(wěn)定等特點，可對男性生育能力進行評估。林峰、陳永艷、康躍凡[4]等人研究顯示，分析SCSA 檢測DFI 與體外受精(IVF)、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)妊娠結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示，SCSA 檢測DFI 對ICSI 的妊娠結(jié)局具有一定的預(yù)測意義，但對IVF 妊娠結(jié)局無預(yù)測作用，因此臨床仍需納入更多樣本進行研究，以進一步驗證。

1.2 單細胞凝膠電泳實驗(SCGE)

SCGE 也可稱之為彗星實驗，主要是由瑞典科學(xué)家Ostling、Johanson 1984年發(fā)明的對毒物DNA 損傷效應(yīng)進行檢測的一種方式。SCGE 適用于所有存在核細胞的組織，可靈敏檢測單鏈、雙鏈DNA 的斷裂，在檢測射線、誘變劑等對DNA 的損傷，檢測環(huán)境污染物對機體造成的損傷等已廣泛應(yīng)用。精子DNA 造受損傷后，其超螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定損害，斷裂DNA 片段在電場作用下，移動至陽極，進而可形成“彗星”尾，而“彗星”頭則是由完整精子DNA 形成。實施SCGE 檢測，需要使用的精子量較少，臨床可依據(jù)電泳液pH 值的不同，對DNA 單鏈、雙鏈損傷進行有效區(qū)分，以此有利于明確不同疾病與不同損傷之間的關(guān)聯(lián)。覃太洲、徐克惠、劉莉[5]等人研究顯示，SCGE 技術(shù)因能夠?qū)NA損傷類型進行區(qū)分，可作為一個有意義的臨床輔助診斷工具。但應(yīng)注意，SCGE 操作具有一定的復(fù)雜性，需要實驗室工作人員熟練掌握操作技術(shù)，同時還應(yīng)在穩(wěn)定的實驗室環(huán)境中與更為敏感智能的圖像采集分析系統(tǒng)進行檢測，以保障檢查結(jié)果準確性。

1.3 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)缺口末端原位標記法 (TUNEL)

TUNEL 法以往臨床多將其用于檢測凋亡細胞DNA 片段中，近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，TUNEL 逐漸應(yīng)用于評估精子DNA 損傷中。TUNEL 主要是一種以異硫氰熒光素(FITC)為標志物，借助TdT 將帶有熒光標記的dUTP 轉(zhuǎn)移至DNA 損傷分子的3'-OH 末端，隨后經(jīng)過顯微鏡或流式細胞儀對DNA 雙鏈、單鏈損傷實施定量分析的一種的檢測方式。相關(guān)報告指出，TUNEL是一種可靠、有效的直接測量DNA 損傷方式，若能確定可靠參考值，該檢測方式能夠作為男性不育個性化、針對性治療的預(yù)后測試方式[6]。

2 SDF 在ART 的臨床意義

DFI 檢測能夠反映精子DNA 損傷程度，對預(yù)測ART 妊娠結(jié)局與自然妊娠具有一定的積極作用，同時可協(xié)助臨床決策的制定[7]。孫園園、李森、陳南僑[8]等人研究顯示，對486 對生殖中心體外受精一胚胎移植(IVF—ET)助孕初篩患者進行SDF 檢測，依據(jù)DFI 分別三組，結(jié)果顯示，DFI 升高可造成精子向前活動力下降，對精液質(zhì)量產(chǎn)生影響，同時降低優(yōu)質(zhì)胚胎率等，影響妊娠結(jié)局。由此得出，對SDF 進行檢測，可有效預(yù)測ART 妊娠結(jié)局。漆艷萍、彭潔、戚青林[9]等人研究SDF 率對ART 結(jié)局的影響，結(jié)果顯示，SDF 率對ART 結(jié)局無明顯性影響，但在一定程度上對受精結(jié)局可造成一定影響。

3 小結(jié)

SDF 檢測方式較多，其中包括SCSA、SCGE、TUNEL 等，但仍缺乏統(tǒng)一明確參考值，造成SDF 檢測在疾病評估、預(yù)測中仍存在一定爭議。其中TUNEL 技術(shù)是檢測SDF 最為直接的方式，其在未來具有更大的發(fā)展前景。SDF 在ART 中具有一定的臨床應(yīng)用價值，可直接反映精子DNA 損傷程度，同時在預(yù)測ART 妊娠結(jié)局中也有一定的積極作用，而在今后若能尋找一種檢測SDF的無損傷方式，直接挑選DNA 完整的精子，以完成受精工作，將ART 的選擇提供更多安全、有效保障。