精子DNA碎片檢測在輔助生殖中的研究進展

陳云斌

（柳州市人民醫院，廣西 柳州，545006）

近年來，隨著生活方式、飲食結構的不斷改變，我國不孕癥患病率也隨之上升，患病率為10%～15%，而因男性所致不孕高達40%，其中10%正常男性與20%～25%不育男性均伴較為嚴重的精子DNA 損害[1]。精子DNA 碎片（SDF）檢測是常規精液分析中的一項重要補充，其是檢測精子功能的重要指標。相關研究顯示，SDF 與氧化應激損傷、精子異常、精子凋亡等具有密切相關的聯系[2]。SDF 指數（DFI）主要是在多種不利條件下，引起DNA 斷裂的精子占全部精子的百分比，其在評估精子DNA 完整性中具有一定的積極作用。相關研究顯示，SDF 檢測水平對輔助生殖技術(ART)治療方式產生一定的影響，可指導ART 治療，但仍存在一定爭議，分析原因可能與SDF 閾值相關[3]。

1 SDF 檢測方式

1.1 精子染色質結構分析法(SCSA）

SCSA 為DNA 碎片檢測的金標準，其主要原理為正常精子DNA緊密結合具有抗酸性，以此保持雙鏈穩定，而遭受損傷的精子DNA 較為疏散，在酸作用下可逐漸形成單鏈，與雙鏈DNA、吖啶橙相結合，可呈現出綠色熒光，而與單鏈DNA 相結合，可呈現出紅色熒光，最終經過流式細胞儀準確、快速以及客觀的對SDF進行測定，具有敏感、結果穩定等特點，可對男性生育能力進行評估。林峰、陳永艷、康躍凡[4]等人研究顯示，分析SCSA 檢測DFI 與體外受精(IVF)、卵胞漿內單精子注射(ICSI)妊娠結局之間的關聯，結果顯示，SCSA 檢測DFI 對ICSI 的妊娠結局具有一定的預測意義，但對IVF 妊娠結局無預測作用，因此臨床仍需納入更多樣本進行研究，以進一步驗證。

1.2 單細胞凝膠電泳實驗(SCGE)

SCGE 也可稱之為彗星實驗，主要是由瑞典科學家Ostling、Johanson 1984年發明的對毒物DNA 損傷效應進行檢測的一種方式。SCGE 適用于所有存在核細胞的組織，可靈敏檢測單鏈、雙鏈DNA 的斷裂，在檢測射線、誘變劑等對DNA 的損傷，檢測環境污染物對機體造成的損傷等已廣泛應用。精子DNA 造受損傷后，其超螺旋結構會發生一定損害，斷裂DNA 片段在電場作用下，移動至陽極，進而可形成“彗星”尾，而“彗星”頭則是由完整精子DNA 形成。實施SCGE 檢測，需要使用的精子量較少，臨床可依據電泳液pH 值的不同，對DNA 單鏈、雙鏈損傷進行有效區分，以此有利于明確不同疾病與不同損傷之間的關聯。覃太洲、徐克惠、劉莉[5]等人研究顯示，SCGE 技術因能夠對DNA損傷類型進行區分，可作為一個有意義的臨床輔助診斷工具。但應注意，SCGE 操作具有一定的復雜性，需要實驗室工作人員熟練掌握操作技術，同時還應在穩定的實驗室環境中與更為敏感智能的圖像采集分析系統進行檢測，以保障檢查結果準確性。

1.3 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)介導缺口末端原位標記法 (TUNEL)

TUNEL 法以往臨床多將其用于檢測凋亡細胞DNA 片段中，近年來，隨著醫學技術不斷發展，TUNEL 逐漸應用于評估精子DNA 損傷中。TUNEL 主要是一種以異硫氰熒光素(FITC)為標志物，借助TdT 將帶有熒光標記的dUTP 轉移至DNA 損傷分子的3'-OH 末端，隨后經過顯微鏡或流式細胞儀對DNA 雙鏈、單鏈損傷實施定量分析的一種的檢測方式。相關報告指出，TUNEL是一種可靠、有效的直接測量DNA 損傷方式，若能確定可靠參考值，該檢測方式能夠作為男性不育個性化、針對性治療的預后測試方式[6]。

2 SDF 在ART 的臨床意義

DFI 檢測能夠反映精子DNA 損傷程度，對預測ART 妊娠結局與自然妊娠具有一定的積極作用，同時可協助臨床決策的制定[7]。孫園園、李森、陳南僑[8]等人研究顯示，對486 對生殖中心體外受精一胚胎移植(IVF—ET)助孕初篩患者進行SDF 檢測，依據DFI 分別三組，結果顯示，DFI 升高可造成精子向前活動力下降，對精液質量產生影響，同時降低優質胚胎率等，影響妊娠結局。由此得出，對SDF 進行檢測，可有效預測ART 妊娠結局。漆艷萍、彭潔、戚青林[9]等人研究SDF 率對ART 結局的影響，結果顯示，SDF 率對ART 結局無明顯性影響，但在一定程度上對受精結局可造成一定影響。

3 小結

SDF 檢測方式較多，其中包括SCSA、SCGE、TUNEL 等，但仍缺乏統一明確參考值，造成SDF 檢測在疾病評估、預測中仍存在一定爭議。其中TUNEL 技術是檢測SDF 最為直接的方式，其在未來具有更大的發展前景。SDF 在ART 中具有一定的臨床應用價值，可直接反映精子DNA 損傷程度，同時在預測ART 妊娠結局中也有一定的積極作用，而在今后若能尋找一種檢測SDF的無損傷方式，直接挑選DNA 完整的精子，以完成受精工作，將ART 的選擇提供更多安全、有效保障。