正確認(rèn)識(shí)眼內(nèi)淋巴瘤分子病理檢查結(jié)果

苗恒，梁建宏

(北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科，眼病與視光醫(yī)學(xué)研究所，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病診治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部眼視光學(xué)院，北京 100044)

眼內(nèi)淋巴瘤是一種主要累及葡萄膜、視網(wǎng)膜和玻璃體的惡性腫瘤性疾病，按主要累及組織和部位可分為玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤和葡萄膜淋巴瘤[1]。約90%的眼內(nèi)淋巴瘤起源于B淋巴細(xì)胞，此外起源于T淋巴細(xì)胞和NK/T細(xì)胞的眼內(nèi)淋巴瘤也偶有報(bào)道[2]。玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的病理類(lèi)型多為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，而葡萄膜淋巴瘤則多起源于黏膜相關(guān)淋巴組織，病理類(lèi)型多為結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤[3]。眼內(nèi)淋巴瘤大多起病隱匿、進(jìn)展緩慢，葡萄膜淋巴瘤更因惰性度高而一度被認(rèn)為是良性淋巴增生性疾病[3]。雖然眼內(nèi)淋巴瘤具備相對(duì)特征性眼底和影像學(xué)表現(xiàn)，但因其表型多樣且經(jīng)常伴隨不同程度的眼內(nèi)炎性表現(xiàn)而被誤診、漏診。

隨著多模式影像、微量標(biāo)本分子和細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，眼內(nèi)淋巴瘤的診斷率和檢出率逐年提高，眼科醫(yī)生對(duì)此類(lèi)疾病的認(rèn)識(shí)也逐年加深[4]。雖然眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理至今仍然是眼內(nèi)淋巴瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但受限于采樣技術(shù)、標(biāo)本保存/運(yùn)輸、病理診斷技術(shù)水平等因素，眼內(nèi)淋巴瘤病理診斷陽(yáng)性率始終偏低[5]。相比之下，只需要少許眼內(nèi)液即可輕松完成的細(xì)胞因子檢測(cè)、流式細(xì)胞免疫分型和基因重排等技術(shù)則具備標(biāo)本獲取和保存難度低、檢測(cè)方法成熟且方便等優(yōu)勢(shì)，備受臨床醫(yī)生推崇，甚至大有在診斷眼內(nèi)淋巴瘤時(shí)只單純依據(jù)此類(lèi)分子/細(xì)胞生物學(xué)的方法而完全放棄病理診斷的趨勢(shì)。認(rèn)識(shí)眼內(nèi)液分子/細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段的優(yōu)勢(shì)和局限性，重視并規(guī)范眼內(nèi)淋巴瘤的病理診斷流程，不但有助于加深對(duì)該類(lèi)疾病臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，還有助于借助分子/細(xì)胞生物學(xué)手段探究其發(fā)病機(jī)制，為優(yōu)化此類(lèi)疾病的治療方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 認(rèn)識(shí)眼內(nèi)液分子/細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段的優(yōu)勢(shì)和局限性

目前臨床用于診斷眼內(nèi)淋巴瘤的分子/細(xì)胞生物學(xué)手段主要包括白細(xì)胞介素10/6比值(interleukin 10/6，IL-10/6)、免疫球蛋白重鏈/T細(xì)胞受體(immunoglobulin heavy chain/T cell receptor，IgH/TCR)基因重排和流式細(xì)胞免疫分型技術(shù)[4]。

IL-10/6因標(biāo)本來(lái)源簡(jiǎn)單及檢測(cè)方法成熟快捷等原因而被廣泛用于臨床疑似眼內(nèi)淋巴瘤患者的篩查環(huán)節(jié)。房水IL-10/6>1診斷眼內(nèi)淋巴瘤的敏感性為75%～88%，特異性為75%～85%，而玻璃體IL-10/6>1診斷眼內(nèi)淋巴瘤的敏感性和特異性更是分別高達(dá)93%和100%[6]。但需要指出的是，該方法成立的前提：患眼為玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤，腫瘤細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞，且要排除可導(dǎo)致IL-10升高的其他原因。葡萄膜淋巴瘤常惰性生長(zhǎng)且位于血-視網(wǎng)膜外屏障之外，因而很難通過(guò)脈絡(luò)膜活檢之外的方法明確診斷，眼內(nèi)液IL-10/6也通常<1[7]。雖然>90%的眼內(nèi)淋巴瘤均來(lái)源于B淋巴細(xì)胞，但少數(shù)情況下，T淋巴細(xì)胞和NK/T細(xì)胞來(lái)源的眼內(nèi)淋巴瘤也可發(fā)生，但此時(shí)IL-10并不升高，因而會(huì)造成IL-10/6<1的現(xiàn)象。此外，已有報(bào)道[8]表明，眼內(nèi)淋巴瘤之外的疾病如處于特定階段的急性視網(wǎng)膜壞死等，也可出現(xiàn)IL-10水平升高甚至IL-10/6>1的情況，此時(shí)需要臨床醫(yī)生結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)和患眼對(duì)治療的反應(yīng)以明確診斷。

IgH/TCR基因重排技術(shù)是一種基于PCR判斷標(biāo)本中是否存在單克隆淋巴細(xì)胞的分子生物學(xué)手段。在血液腫瘤領(lǐng)域，IgH/TCR基因重排已具備標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)流程(EuroClonality/BIOMED-2指南)且已是確定診斷的常規(guī)依據(jù)之一[9]。但在眼科領(lǐng)域，受到標(biāo)本采集量，特別是標(biāo)本微切(micro-dissection)技術(shù)實(shí)現(xiàn)難度大的限制，該技術(shù)至今仍沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化流程可循，直接將眼內(nèi)液標(biāo)本整體或離心后取沉淀送檢的假陰性率仍然偏高(約40%)[10]。此外，基因重排結(jié)果陽(yáng)性?xún)H表示該標(biāo)本中存在單克隆的B/T淋巴細(xì)胞，卻并不表示此類(lèi)細(xì)胞一定是腫瘤細(xì)胞。炎癥背景下的淋巴細(xì)胞單克隆反應(yīng)性增生也是基因重排陽(yáng)性的原因之一[11]。因此在獲得基因重排陽(yáng)性結(jié)果后，還要綜合其他診斷手段判斷其性質(zhì)，而不能據(jù)此確診眼內(nèi)淋巴瘤。

流式細(xì)胞免疫分型是基于流式細(xì)胞術(shù)和大樣本數(shù)據(jù)的細(xì)胞定量分型技術(shù)，可快速計(jì)數(shù)標(biāo)本中特殊免疫表型的細(xì)胞數(shù)量和百分比，同樣也是血液腫瘤診斷的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之一。在眼科領(lǐng)域，因眼內(nèi)液標(biāo)本獲取相對(duì)困難且細(xì)胞密度低，標(biāo)本分裝后用于流式細(xì)胞免疫分型的細(xì)胞總數(shù)通常至多只有2 000個(gè)，且因標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸、處理等原因，“不典型”免疫表型的細(xì)胞常見(jiàn)。此外，如同基因重排一樣，即便檢測(cè)到κ/λ限制性表達(dá)的淋巴細(xì)胞，也只能說(shuō)明標(biāo)本中存在單克隆的淋巴細(xì)胞，但其意義不明[12]，因而不能作為眼內(nèi)淋巴瘤的確診依據(jù)。

IL-10/6、IgH/TCR基因重排和流式細(xì)胞免疫分型技術(shù)都是依據(jù)淋巴瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，檢測(cè)其存在時(shí)可能發(fā)生的繼發(fā)現(xiàn)象，進(jìn)而間接推理其存在的方法，任何一種方法均不能直接“見(jiàn)到”也不能確定腫瘤細(xì)胞的存在。雖然該類(lèi)檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便和高效的特征，但終究不能作為眼內(nèi)淋巴瘤的確診依據(jù)或診斷金標(biāo)準(zhǔn)。

2 重視眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理對(duì)眼內(nèi)淋巴瘤的診斷價(jià)值

病理是腫瘤類(lèi)疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。對(duì)眼內(nèi)淋巴瘤而言，獲得病理依據(jù)不但可以明確診斷，還可根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷其病理類(lèi)型并預(yù)測(cè)預(yù)后。雖然相比現(xiàn)今各種眼內(nèi)液分子/細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段，眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理具備采樣難度大，標(biāo)本保存運(yùn)輸困難，受各地病理診斷水平限制等短板，但不容置疑的是，眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理可在直視下證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在，因而仍然是眼內(nèi)淋巴瘤的診斷金標(biāo)準(zhǔn)方法，是此類(lèi)疾病診斷時(shí)必不可或缺的送檢項(xiàng)目之一。雖然因各種原因，其敏感性低于眼內(nèi)液分子/細(xì)胞生物學(xué)手段，但也不能因此而放棄送檢病理標(biāo)本甚至忽視其重要性。

3 規(guī)范和優(yōu)化眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理標(biāo)本的采集、保存和送檢流程

有效采集眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理標(biāo)本可顯著改善眼內(nèi)淋巴瘤的病理診斷效率。1)采樣前應(yīng)停用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物至少2周以避免其誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡[13]。2)采樣時(shí)首選玻璃體切割術(shù)中標(biāo)本，切速≤800 min?1，且在不打開(kāi)灌注的情況下干切眼底病灶附近的玻璃體，提高腫瘤細(xì)胞采集陽(yáng)性率[13]。3)采樣時(shí)同時(shí)采集玻璃體原液和灌洗液并分別送檢可提高陽(yáng)性率[14-15]。4)玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤患眼首選玻璃體標(biāo)本，而葡萄膜淋巴瘤則需根據(jù)腫瘤累及部位和標(biāo)本獲取的難易程度判斷標(biāo)本種類(lèi)和標(biāo)本獲取方式：若腫瘤只累及脈絡(luò)膜則只能選擇脈絡(luò)膜標(biāo)本，但若腫瘤同時(shí)/主要/只累及睫狀體，則經(jīng)鞏膜入路的睫狀體活檢為首選方法，對(duì)同時(shí)/主要/只累及虹膜的患眼則可經(jīng)角鞏膜緣入路獲取虹膜標(biāo)本[16]。對(duì)首次玻璃體標(biāo)本活檢陰性但仍高度疑似玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的患眼，可進(jìn)行二次玻璃體活檢或選擇病灶處視網(wǎng)膜活檢；因淋巴瘤細(xì)胞主要位于視網(wǎng)膜色素上皮與Bruch膜之間，送檢組織應(yīng)包含視網(wǎng)膜色素上皮層及其附近組織[17]。5)玻璃體標(biāo)本在采集后應(yīng)立即放入細(xì)胞培養(yǎng)液中(如含葡萄糖的RPMI1640)并于1 h內(nèi)送病理科[18]。如果能在取材后立即就地完成甩片和固定過(guò)程而后再送檢則形態(tài)更佳。6)固定液可顯著影響腫瘤細(xì)胞形態(tài)，PreservCyt固定液可有效保護(hù)淋巴瘤細(xì)胞的形態(tài)和DNA的完整性[19]。7)玻璃體原液在離心后，上清可送檢IL-10/6，沉淀重懸后可送檢病理和IgH/TCR基因重排。而灌洗液則可在離心后取沉淀，重懸后送檢流式細(xì)胞免疫分型，以最大化利用標(biāo)本[17]。8)細(xì)胞病理甩片標(biāo)本可進(jìn)一步通過(guò)標(biāo)本微切(micro-dissection)技術(shù)切取其中高度疑似腫瘤細(xì)胞的部分進(jìn)行IgH/TCR基因重排檢測(cè)，以提高其陽(yáng)性率[20]。

綜上，眼內(nèi)液分子/細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)雖然簡(jiǎn)便快捷，但因其本身只能作為眼內(nèi)淋巴瘤診斷的“間接證據(jù)”而不能作為確診依據(jù)。眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理仍然是眼內(nèi)淋巴瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其價(jià)值和地位不能被其他任何分子/細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段所替代。規(guī)范和優(yōu)化眼內(nèi)組織/細(xì)胞病理標(biāo)本的采集、保留和送檢流程對(duì)提高眼內(nèi)淋巴瘤的病理診斷率有重要意義。眼科醫(yī)生應(yīng)充分理解并掌握各種診斷、檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和局限性，在臨床工作中有側(cè)重的選擇恰當(dāng)?shù)脑\斷技術(shù)，提高眼內(nèi)淋巴瘤的診斷效率，提高醫(yī)療質(zhì)量。

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