畜禽骨骼肌發育相關lncRNA研究進展

劉一飛

（山西農業大學動物醫學學院，山西太原030032）

畜禽肌肉的生產與消費一直在國民經濟中占有顯著地位，研究畜禽骨骼肌的發育和調控過程對于促進畜牧業的良性發展具有重要意義。就骨骼肌的發育階段而言，畜禽的肌肉發育大致經歷以下過程：（1）由體節分化形成含有肌源性前體細胞的生皮肌節；（2）肌前體細胞增殖、分化生成成肌細胞；（3）成肌細胞進一步增殖，隨后分化和融合形成肌管；（4）最后，肌管發育成熟形成肌纖維[1]。畜禽出生后，肌細胞數量已確定不再增加，而骨骼肌的生長主要是通過增加現有肌纖維的肥大而實現。因此，深入了解骨骼肌的發育調控機制已成為生命科學的研究熱點，以期滿足畜牧業提高畜禽肉產品質量的迫切需求。骨骼肌的生長發育受多種因素的調控，如營養、遺傳和環境。在遺傳學研究中，以往的研究主要關注蛋白質編碼基因在骨骼肌生長發育中的作用，如Pax 3、Pax 7、MyoD、Myf 5、MyoG以及Mef 2等生肌調節因子和肌肉發育相關轉錄因子[2]。后來發現非編碼RNA占轉錄組的絕大部分，且哺乳動物基因組中只有不到2%的基因編碼蛋白質[3]。因此，科學家們推測如此眾多非編碼RNA的存在一定具備其獨特生物學功能，而非冗余無用的“噪音”序列。lncRNA作為非編碼RNA的研究熱點，已發現其在肌細胞分化、脂肪生成、炎癥反應、腫瘤發生中廣泛參與機體的各項生理病理過程。目前，國內外有關畜禽骨骼肌lncRNA高通量測序和生物學功能研究正在有序開展。筆者就近年來涉及牛、豬、羊、雞骨骼肌發育調控的lncRNA研究做出扼要綜述，旨在為后續的相關基礎研究提供借鑒。

1 長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）簡介

lncRNA是一類由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ指導轉錄、轉錄本長度大于200 nt，且不編碼蛋白質的RNA（不含rRNA），廣泛存在于各種真核生物體內。近年來的功能基因組研究表明，lncRNA在整個轉錄組中占比很高，其表達豐度遠遠超過編碼基因的轉錄本。哺乳動物基因組序列中有4%～9%的序列可產生lncRNA[4]。利用高通量測序技術對真核生物進行轉錄組研究發現，基因組上編碼lncRNA的序列是編碼mRNA序列的10～20倍[5]。RNA聚合酶Ⅱ轉錄的lncRNA具有與mRNA類似的特征，包括5′端帽子結構、啟動子、可變剪切及PolyA尾，只有很短的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）或者根本沒有[4-6]，而由RNA聚合酶Ⅲ轉錄的lncRNA則無PolyA尾[7]。由于不編碼任何蛋白質，且絕大部分lncRNA一級結構在不同物種間的保守性較差，使得lncRNA在發現伊始曾一度被認為是轉錄“噪音”，其對應的基因組序列也被漠視為“垃圾”DNA不具有生物學功能[8]。但隨著研究的深入，尤其是2012年人類基因組ENCODE項目（DNA元素百科全書項目）的實施，才逐漸揭示出lncRNA不僅不是無義序列，而能在染色體修飾（表觀遺傳水平）、轉錄調控（轉錄水平）和轉錄后調控（翻譯水平）中發揮重要作用，以多種方式調控基因表達的活性分子[9-11]。此外，lncRNA的表達具有很強的依賴發育階段、組織細胞和生理病理狀態的時空特異性[12-13]。通常，lncRNA是以順式作用方式（cis）或反式作用方式（fans）來調控基因的表達，廣泛參與諸如X染色體沉默、基因組印記、細胞分化發育、細胞周期調控、剪接調控、mRNA降解、細胞自噬以及免疫炎癥等生理和病理進程[14-18]。

2 牛骨骼肌發育相關的lncRNA

2.1 牛骨骼肌lncRNA高通量測序研究

牛骨骼肌相關lncRNA的研究目前集中于不同發育階段、不同部位的高通量測序分析和特定lncRNA的生物學功能分析。BILLEREY等[19]首次運用雙端RNA測序技術鑒定出了利木贊牛背最長肌中的584種lncRNA，這些lncRNA具有哺乳動物相同的特征，即與蛋白編碼基因轉錄本相比較，具有較短的轉錄本和相應較短的基因長度、僅含有少量的外顯子，而且表達量顯著降低。LncMD1是最先被發現的參與肌生成的lncRNA之一，僅在肌肉中特異表達。其可作為競爭性內源RNA與miR-133和miR-135相互作用，調節MAML1和MEF2C的表達（MAML1和MEF2C是激活分化晚期肌細胞內增殖分化相關基因的轉錄因子）[20]。隨后，SUN等[21]對胚胎期、幼齡期和成年期的秦川牛背最長肌進行了lncRNA測序，發現lncMD可作為競爭性內源RNA（ceRNA）通過與miR-125b結合起到分子海綿的作用，促進肌肉的分化。且lncMD水平與miR-125b的靶基因胰島素樣生長因子（IGF2）的mRNA表達呈顯著正相關。為了明確不同部位骨骼肌中lncRNA的表達差異，有研究對海福特肉牛的背、肩、肋和臀4個部位的肌肉樣品進行了lncRNA測序，共鑒定出7 188條lncRNA序列，同樣發現這些lncRNA具有更短的ORF以及比mRNA更少的表達量[22]。同時確定了若干IncRNA的染色體定位和整體表達模式，整合分析了與肌肉發育相關的36個IncRNA、62個miRNA和12個mRNA之間的互作關系，并通過深入分析lncRNA-miRNA-mRNA的相互關系揭示了牛骨骼肌特有的IncRNA整體表達模式和肌肉發育的重要調控靶位。張曉娟等[23]分別采集3月齡胚胎、6月齡胚胎及9月齡初生和牛的背腰肌、腿臀肌、肩胛肌和肋間肌樣品進行了高通量測序分析，共鑒定出212 851條新的未注釋lncRNA，不同時期差異表達的9 913條，篩選出與肌肉生成相關的lncRNA 55條、候選靶標mRNA 38條。靶標mRNA分別富集在肌動蛋白細胞骨架調節、肌動蛋白結合、骨骼肌細胞分化、組織肌肉形態、細胞骨架和凋亡調控6個詞條。

2.2 牛骨骼肌lncRNA的功能研究

牛骨骼肌lncRNA的功能研究較其他物種相對匱乏，但在成肌細胞增殖、分化中已取得一定進展。張俊星等[24]基于牛骨骼肌衛星細胞轉錄組的測序結果，選定lnc4351合成其siRNA進行表達干擾。結果表明，下調lnc4351表達可顯著抑制衛星細胞增殖，誘導分化后肌肉生長相關因子MyoG和MHC蛋白水平顯著上調，促進了牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化。李燕等[25]研究表明，LncRNA-133a在3月齡胎牛肌肉組織中表達量最高，6月齡胎牛次之，9月齡胎牛及成年牛肌肉組織中表達量最低，其時序表達呈下降趨勢。利用構建的過表達LncRNA-133載體（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a）和LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a）轉染牛骨骼肌衛星細胞發現，成肌因子MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表達水平分別顯著升高和下降，證實了LncRNA-133a具有促進牛骨骼肌衛星細胞增殖及分化的作用。LI等[26]對90日齡和24月齡的秦川牛背最長肌進行高通量測序后，鑒定出13 580個候選lncRNA，多數在2個發育階段呈現差異表達。選擇所有下調lncRNA中表達量最高的lncMDNCR進行熒光素酶、RNA結合蛋白免疫共沉淀和Pull-down分析，結果發現，這些表達量最高的lncMDNCR通過32個潛在結合位點與miR-133a直接作用，可作為miR-133a的分子海綿抑制細胞增殖同時促進成肌細胞分化。

3 羊骨骼肌發育相關的lncRNA

3.1 羊骨骼肌lncRNA高通量測序研究

羊肉作為我國北方居民秋冬季肉產品消費的主要膳食來源，隨著飼養規模的不斷擴大，與羊骨骼肌相關lncRNA的研究也在逐步開展，涉及的研究領域主要包括不同發育階段和不同品種間差異表達lncRNA的篩選。LING等[27]通過高通量測序對山羊骨骼肌發育的7個時段lncRNA的表達進行了分析。結果表明，所選擇的7個發育階段中共鑒定出15 079個lncRNA，呈現差異表達的有547個lncRNA。此外，經構建lncRNA-mRNA共表達網絡分析后推測，lnc_007561、lnc_001728與lnc_011371可能在山羊骨骼肌發育中起重要調控作用。REN等[28]運用鏈特異性RNA測序系統對我國湖羊骨骼肌發育的3個關鍵時期（胚胎期、羔羊期和成年期）的lncRNA進行了篩選。共獲得6 924個骨骼肌相關lncRNA，基于GO和KEGG數據的功能注釋分析得出，差異表達的lncRNA顯著富集于器官形態發生、骨骼肌系統發育、刺激反應以及其他與肌肉相關的詞條中。此外，該研究通過構建lncRNA與差異表達靶基因的共表達網絡后發現，有7個lncRNA及其靶基因在肌肉生長中發揮重要作用。CHAO等[29]通過分析杜泊羊、美利奴羊肉羊與小尾寒羊間骨骼肌lncRNA的表達差異性，共篩選到39個lncRNA。經功能注釋和共表達分析得出，29個lncRNA與細胞增殖、肌肉發育及代謝、凋亡等生命過程相關。

3.2 羊骨骼肌lncRNA的功能研究

羊骨骼肌lncRNA的功能研究涉及對成肌細胞、衛星細胞分化的促進或抑制等方面。吳明明[30]對胚胎期90、120日齡綿羊背最長肌進行了高通量測序，共得到1 114個lncRNA，經定量篩選后得到1個在胚胎期綿羊骨骼肌中特異性高表達的上調lncRNA（lnc-SEMT）。通過檢測不同生長期綿羊的lnc-SEMT表達水平發現，在胚胎期120日齡時，該lncRNA的表達量最高，且出生后逐漸降低，至成年后表達水平趨于平穩。此外，該研究還分別通過構建lnc-SEMT的高表達和干擾載體轉染綿羊成肌細胞、顯微注射培育了轉lnc-SEMT綿羊。結果表明，隨著分化的進行，lnc-SEMT的表達量與MyoD、MyoG的表達量呈正相關；轉基因突變綿羊的lnc-SEMT表達量為野生型綿羊的3.3倍，且轉基因綿羊的肌纖維橫截面積顯著高于野生對照組。提示lnc-SEMT分子在綿羊成肌細胞分化過程中具有促進分化的功能。睢夢華[31]基于前期的安徽白山羊骨骼肌測序數據，篩選到lnc_002783作為功能研究對象，通過干擾其表達發現，lnc_002783與miR-188-5p的表達呈負相關，在白山羊骨骼肌衛星細胞的增殖過程中分別起促進和抑制作用。由此確定lnc_002783與miR-188-5p與白山羊骨骼肌發育相關且二者存在靶向關系，并且lnc_002783對衛星細胞的分化起抑制作用。

4 豬骨骼肌發育相關的lncRNA

4.1 豬骨骼肌lncRNA高通量測序研究

豬骨骼肌發育相關的lncRNA測序主要涉及不同品種、不同發育階段和不同生理狀態方面。GAO等[32]對比了1、90和180日齡大白豬和馬身豬骨骼肌lncRNA的表達譜，共鑒定出5 153個新型lncRNA，有1 407個lncRNA在2個品種中具有相同的的表達模式。為探知DNA甲基化對豬骨骼肌發育的影響，YANG等[33]通過整合肥胖型通城豬、瘦型長白豬和迷你型五指山豬的全基因組DNA甲基化、mRNA、lncRNA和miRNA譜共鑒定出10 813個lncRNA，包括UCP3、FHL1、ANK1、HDAC4、HDAC5在內的一組lncRNA和mRNA，它們對應DNA的甲基化與表達水平呈負相關變化，共有253個差異表達的甲基化基因與體型和肥胖相關。ZHAO等[34]首次對豬胎兒骨骼肌lncRNA轉錄本進行了系統鑒定分析，鑒定出570種含有多個外顯子的基因間lncRNA，并且提出豬lncRNA傾向性地位于介導轉錄調控的基因附近，而不是具有發育功能的基因附近。TANG等[35]對初生、30日齡和240日齡的貴州小型豬的背最長肌和240日齡貴州小型豬9個組織中lncRNA進行了高通量測序，鑒定出10 813個lncRNA，其中9 075個為新型lncRNA。保守模式分析顯示，57%的豬lncRNA與人類和小鼠具有同源性。5 455個lncRNA表現出典型的調控分子特征，具有高度的時空特異性。XING等[36]首次構建了去勢和未去勢淮南公豬背最長肌的轉錄組圖譜，共鑒定出8 946種lncRNA，包含6 743個基因間lncRNA，498個反義lncRNA和1 705個內含子lncRNA。在未去勢和去勢組之間存在385個差異表達的lncRNA，這些差異表達lncRNA與其靶基因可能參與雌激素受體信號通路和骨骼肌發育過程。

4.2 豬骨骼肌相關lncRNA的功能研究

前期對于小鼠和人類的研究發現，lncRNA可經由與轉錄因子等蛋白復合物相互作用，調節免疫細胞-T細胞、樹突狀細胞的分化和炎癥反應中相關炎癥因子的表達[37-39]。為了解系統性炎癥反應對豬骨骼肌中lncRNA差異表達的影響，張琳等[40]建立了斷奶仔豬脂多糖（LPS）應激模型，對前期篩選出的12個骨骼肌lncRNA進行了差異比對分析。結果表明，LPS刺激極顯著降低骨骼肌中lncRNA-36199.1的表達量，lncRNA-24886.1和lncRNA-33904.1的表達量亦有下降趨勢。提示這些lncRNA可能在免疫細胞的分化過程中通過其差異表達起到調控免疫細胞的功能，同時lncRNA亦可通過對炎癥因子表達的調控，參與對仔豬骨骼肌炎癥反應的調控。目前，已鑒定出相當數量的lncRNA參與調控豬骨骼肌生長發育，但其中多數的調控功能仍有待進一步研究。譚婭等[41]于前期高通量測序中鑒定出一條新的豬骨骼肌lncRNA G1430，為探究其生物學功能，運用生信分析對其與豬肉性狀進行了關聯分析。結果表明，lncRNA G1430的高表達與肉質高pH、低滴水損失以及低肉色亮度相關，并且lncRNA G1430的表達與糖酵解基因-多肌醇-多磷酸磷酸酶1（MINPP1）呈顯著正相關，而與醛酮還原酶家族1成員A1（A1AKR1A1）、葡萄糖激酶（GCK）呈顯著負相關。提示lncRNA G1430可能靶向調節上述3種基因的表達，參與糖酵解和能量代謝過程，進而對豬肉品質產生影響。Lnc H19是較早發現的在小鼠胚胎轉錄本中高表達的長鏈非編碼RNA，且H19基因無蛋白編碼能力，在多個物種中其基因序列的外顯子區域保守性高，很少發生突變[42]。骨骼肌衛星細胞的分化是骨骼肌發育的重要過程，為研究lnc H19對豬骨骼肌衛星細胞的肌纖維轉化的作用，姚瑩[43]研究了H19對豬骨骼肌衛星細胞分化的影響。結果顯示，H19在衛星細胞分化過程中持續高表達，且慢肌中的表達量顯著高于其他組織。進一步通過siRNA干擾H19表達發現，慢肌相關蛋白表達量顯著下降，而快肌相關蛋白表達量顯著升高。證明H19在豬骨骼肌纖維類型轉化中起調控作用。

5 雞骨骼肌發育相關的lncRNA研究進展

5.1 雞骨骼肌lncRNA的高通量測序研究

相較于牛、豬等哺乳動物的lncRNA研究數量，lncRNA在雞骨骼肌發育中的研究相對較少。LI等[44]首次利用RNA-Seq技術開展了雞肌肉發育過程中的轉錄組系統鑒定，共鑒定出281個新的基因間lncRNA。這些lncRNA總體上比蛋白編碼基因保守程度低，但比隨機非編碼序列的保守性高。為探討lncRNA在雞肌肉發育過程中的表達特征，LI等[45]以6周齡、14周齡、22周齡和30周齡固始雞胸肌為材料構建了12個cDNA文庫，經高通量測序共鑒定出1 252個新lncRNA和1 376個注釋lncRNA。在14周齡與6周齡對比組、22周齡與14周齡對比組、22周齡與6周齡對比組、30周齡與6周齡對比組、30周齡與14周齡對比組、30周齡與22周齡對比組間分別發現了53、61、50、153、117、78個差異表達lncRNA，這些lncRNA主要分布在1號染色體。在22周齡與14周齡對比組中，發現了與肌肉發育相關的GO詞條，表明在14周齡到22周齡這一階段存在與肌肉生長發育密切相關的lncRNA及其靶基因。同時，GO富集分析顯示，MAPK信號通路是不同對照組中最頻繁富集的通路之一，MEF2C與其靶標lncRNA（ALDBGALT0000008862，ALDBGALT0000008865和LNC_001247）可 能 經MAPK通路調控肌肉發育。該項研究首次揭示了固始雞胸肌中lncRNA表達在不同時期的動態變化，揭示了MAPK信號通路在肌肉發育中起著至關重要的作用。與牛、豬的胚胎骨骼肌lncRNA研究范疇類似，有研究亦開展了雞生命早期骨骼肌中差異表達lncRNA的篩選，LI等[46]對孵化期第11日、16日雞胚和初生1日齡雛雞的腿肌lncRNA和mRNA轉錄本進行了聯合分析，共鑒定出129、132、45個差異表達lncRNA和1 798、3 072、1 211個差異表達的mRNA。并且在孵化期第11日與第16日雞胚對比組和第11日雞胚與1日齡雛雞對比組中，通過生信分析差異表達lncRNA后，分別預測出126、200個順式靶基因和2、3個反式靶基因，第16日雞胚與1日齡雛雞對比組中預測出25個順式靶基因。進而由此構建了lncRNA-mRNA的共表達網絡，為雞骨骼肌lncRNA的功能性研究奠定了基礎。

5.2 雞骨骼肌相關lncRNA的功能研究

lncRNA能通過多種作用機制調節機體功能，由于高通量RNA-seq研究中已鑒定出較多可能參與雞骨骼肌生長發育的lncRNA，當前的研究側重于從分子細胞水平探討lncRNA在雞骨骼肌生長發育過程中的調控作用機制。lncRNA的功能性研究發現，其可通過吸附miRNA和短分子微肽達到調控骨骼肌發育相關重要基因的表達，進而影響雞肌肉的生長發育。首先，一些lncRNA也可以通過編碼微肽調節骨骼肌生長發育。例如，在雞胸肌組織中高表達的lncRNA-Six1，可編碼產生一個相對分子質量約7 260的微肽，該微肽以順式作用方式調控Six基因表達，具有促進骨骼肌細胞增殖的生物學功能[47]。其次，lncRNAs亦可以作為競爭性內源RNAs（ceRNAs）在雞骨骼肌生長發育中發揮作用。MA等[48]研究表明，在雞肉中特異表達的miR-1611同時包含lncRNA-Six1和Six1的潛在結合位點，它可以與lncRNA-Six1形成內源性競爭來調節Six1的表達。過表達miR-1611可抑制雞成肌細胞的增殖和分化。此外，miR-1611在雞慢肌纖維中高表達，隨著表達的增加由其促進快肌纖維向慢肌纖維轉變。

6 展望

在人與模式動物中，lnc-MD1、Yam-1、sirt1 AS和H19是涉及肌肉發育的眾多lncRNA中功能研究較多的4個，這些lncRNA都與一個或幾個miRNA相互作用，影響成肌分化。但這些lncRNA在畜禽中的研究報道還相對較少。隨著RNA測序技術的不斷推進，愈來愈多畜禽在不同生命階段、不同生理狀態以及不同組織細胞、不同品種間的lncRNA將被陸續鑒定出來。鑒于lncRNA在物種間的不保守性以及作用方式和表達模式的多樣性和復雜性，今后lncRNA的研究方向仍應以闡明特定lncRNA的生物學功能為主，尤其是與畜禽生長發育、營養代謝、繁殖育種和機體健康相關的lncRNA。同時結合不斷發展的生物技術和生信分析工具完成諸如lncRNA的靶基因的預測與驗證，揭示lncRNA的高級結構，篩選互作蛋白、RNA、DNA等研究工作，進一步探尋lncRNA的產生和調節機制。