高危非肌層浸潤性膀胱癌分子分型的價值與研究現狀

蔣 凡，賀大林，吳開杰

(西安交通大學第一附屬醫院泌尿外科，陜西西安 710061)

膀胱癌(bladder cancer,BCa)是泌尿系統中僅次于前列腺癌之后第2位的常見腫瘤，在各種腫瘤中，其發病率居第11名。全世界范圍內，男性膀胱癌年齡標準化發病率為9.0/(10萬人·年)，女性為2.2/(10萬人·年)[1-2]。初診的膀胱癌中，75%為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)，包括Ta、CIS、T1期。對于NMIBC患者，通常選擇經尿道膀胱腫瘤切除術+術后輔助灌注治療[3]，然而50%～70%的患者會復發，10%～15%的患者會進展為肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)。

在NMIBC中，T1HG或T1G3膀胱癌是最復雜的一種，其臨床特征、生物學和組織學特征是可變且不可預測的，目前尚無明確的標準來判斷和區分這種高危NMIBC復發和進展的風險，對泌尿外科醫生和患者來說都是一個巨大的挑戰。因此，確定可以對這些患者進行危險度分層并指導后續治療抉擇的方法十分重要。伴隨著生物檢測技術的快速發展，通過基因測序或分子標記物檢測對T1HG膀胱癌進行分子分型有望解決這一難題[4]，更好地指導臨床選擇早期根治性膀胱全切抑或保留膀胱的治療策略。

遺憾的是，膀胱癌分子分型相關的研究大多是基于MIBC完成的，關于NMIBC的基因檢測和分子分型的研究工作相對較少，也沒有形成統一的共識，本文將梳理高危NMIBC基因檢測或分子分型的最新研究進展以及其潛在的臨床價值，以期為高危NMIBC的臨床治療決策提供幫助。

1 膀胱癌分子分型研究現狀

目前有關膀胱癌分子分型的研究主要集中在MIBC，已報道的研究包括貝勒大學(Baylor)、北卡羅來納大學(the universityof north carolinaat，UNC)、德克薩斯大學安德森癌癥中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center，MDA)、腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、Cartes d’Identité des Tumeurs Curie(CIT-Curie)和瑞典隆德大學(Lund6)6種，均基于基因測序和聚類分析的方法建立。為了便于臨床普遍開展，也有學者認為可以利用CK5/6、CK20、CD44及GATA3等常見分子標記物的免疫組化染色來簡單區分，分為管腔型(luminal)和基底型(basal)。對于NMIBC分子分型研究相對較少，為大家熟知的有UROMOL分型。

1.1 MIBC分子分型的共識盡管MIBC的分子分型已經比較完善，但上述6種方法仍有不同，為了方便使用，國際上綜合上述方法，達成共識，將MIBC分為6種[5]，分別為luminal papillary型(LumP型)、luminal Non-specified型(LumNS型)、Luminal Unstable型(LumU型)、stroma-rich型、Basal/Squamous型(Ba/Sq型)和Neuroendocrine-like型(NE-like型)。在基因組改變上，LumP型主要富含FGFR3突變、KDM6A突變以及CDKN2A的缺失；LumNS型的主要特征是ELF3突變和PPAGR改變；LumU型腫瘤主要是發生PPAGR的突變、包含E2F3和SOX4的6p22.3區域的高水平擴增、ERBB2突變、TP53突變，它是基因組改變最顯著的一類；對于Ba/Sq型腫瘤，其主要改變是TP53和RB1突變，部分也存在3p14.2的缺失；在NE-like型中，同時存在TP53和RB1的失活；stroma-rich型的基因變化不明顯。

1.2 MIBC分子分型的特征研究表明，MIBC的分子分型與臨床特征密切關聯[5]，Ba/Sq型在女性和T3/T4分期中的比例較高，LumP型和LumU型在T2期中較多，LumP型在年齡偏小(<60歲)的患者中較多，而LumNS型在年齡偏大(>60歲)的患者中較多。同時，MIBC的基因分型有助于醫生判斷患者的臨床預后，在這6種類型中，LumP型的預后最好，LumU型和Ba/Sq型的預后相對不好，NE-like型的預后最差。

1.3 MIBC分子分型的價值MIBC的分子分型在治療方面有重要的指導作用，可以幫助預測化療、免疫檢查點抑制劑及其他新型藥物的療效。LumP型腫瘤中纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)的突變率和易位率高，提示LumP型腫瘤可能對FGFR3抑制劑有反應[6]。Ba/Sq型表達高水平的表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)及配體，提示其可能對EGFR的靶向療法敏感。同時，Ba/Sq型高表達免疫檢查點標記和抗原呈遞相關基因，提示其對免疫療法可能有較高的敏感性。NE型和LumU型腫瘤對放射療法具有潛在的反應，表現為細胞周期活性增強和低氧信號。在新輔助治療方面，Ba/Sq型和LumNS型腫瘤患者可能受益，stroma-rich型則不會受益。基于以上特征，可以幫助醫生為患者選擇更合適的治療方式。

2 高危NMIBC分子分型的研究狀況

目前認為，NMIBC和MIBC之間的癌基因存在差異擴增和上調，同時在抑癌基因中也存在不同的突變和染色質修飾行為[7]。在癌基因方面，FGFR3在NMIBC中更常見，通常會有較好的預后。E2F3通常在MIBC中表達增加或者上調，如果在NMIBC中出現，則預示進展的風險增高。低級別腫瘤中的STAG2突變率較高，染色質修飾基因突變率較高，例如KDM6A突變率為24%，PTEN雜合子和純合子突變分別為22%～55%和4%～6%，KMT2D失活突變為77%，這為風險評估提供了新的手段[7]。鑒于它們的差異，我們有必要對NIMBC進行相應的分子分型。

2.1 NIMBC分子分型的方法

2.1.1基因(12種)分類 DYRSKJOT等[8]的一項研究發現周圍有原位癌(carcinoma in situ，CIS)和沒有CIS的移行細胞癌的基因表達有很大的區別，周圍有CIS的NMIBC與MIBC之間存在相似的基因表達，但沒有發現CIS與浸潤性癌有密切關系。基于此，他們建立一個包含16個基因的CIS分類器，能夠根據周圍CIS的存在與否對NMIBC進行分類。在這項研究中，CIS基因特征不僅在CIS中存在，在NMIBC、MIBC及正常膀胱尿路上皮中也存在，CIS的存在與疾病進展的風險相關。之后該團隊在原有研究的基礎上進一步優化，確定將以下12個基因作為判斷預后的標記，與非進展性腫瘤相比，進展性腫瘤有7種基因表達上調(KPNA2、BIRC5、UBE2C、CDC25B、COL4A1、MSN和COL18A1),有5種下調(COL4A3BP、MBNL2、NEK1、FABP4和SKAP2)，從而鑒別出進展風險更高的腫瘤[9]。他們的這項研究是基于臨床終末結果來尋求生物標記物，對于NMIBC的分型具有重要意義。

2.1.2UROMOL研究 UROMOL研究是一項尋找NMIBC進展預測因子的大型研究[10]，由歐洲7家機構合作進行。該項研究納入460例NMIBC患者，通過全面的轉錄水平分析及共聚類分析，確定了一個基于117個基因的分類器，將NMIBC分為3類。在臨床特征方面，第2類和第3類中高級別、高分期、合并CIS以及進展為MIBC的腫瘤更常見。在分子特征方面，第1類和第2類均表現出luminal型特征，均高度表達尿路蛋白和分化相關標記物。第1類腫瘤預后較好，細胞周期早期基因高表達。第2類腫瘤預后較差，細胞周期晚期基因高度表達，與CIS病變相關的KRT20、標記腫瘤干細胞的ALDH1A1、ALDH1A2、NES、THY，以及與上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關的轉錄因子高度表達。第3類表現出basal型的特征，標記未分化細胞(即基底細胞)的KRT5/15和CD44表達增高，其基因改變以抑制為主，具有較低的細胞周期和代謝活性，提示其可能處于休眠狀態。在第2類和第3類腫瘤中，KRT14的表達均增加，KRT14通常在KRT15表達之前的未分化細胞中高表達，提示第3類可能會轉變為第2類。除此之外，第2類具有重要的腫瘤驅動基因突變(TP53和ERBB2)和APOBEC相關突變特征，與DYRSKJOT等確定的進展高風險腫瘤類型具有相似的基因改變，提示其可能通過CIS通路進展。第1類和第3類具有FGFR3突變特征，提示其可能通過Ta通路進展。此項研究第一次在NMIBC中發現基底型特征，加深了對于NMIBC的認識，進而優化患者的治療與管理。

2.1.3基因(5種)分類 HEIJDEN等[11]的研究第一次聚焦T1HG高危NMIBC的分子分型。他們對無CIS的進展性和非進展性T1HG膀胱癌的差異基因表達水平進行了研究，最終確定了1組預測進展風險的5項基因標志(ANXA10、DAB2、HYAL2、SPOCD1和MAP4K1)，這5個基因之間并沒有直接的相互作用，在不同的途徑起作用。在之前的研究中，ANXA10、DAB2、HYAL2、MAP4K1已被證實與膀胱癌相關，SPOCD1的變化是第1次被報道與膀胱癌相關聯。相較于之前的研究，該項研究的優勢在于使用qPCR的方法，操作簡單，成本較低，便于在臨床中開展。

2.1.4基因(8種)分類 KANG等[12]對103例NMIBC患者的標本進行了全基因組表達分析，鑒定出與T1HG膀胱癌患者病情進展相關的8個基因(S100A8、PFKFB4、HMOX1、KIF1A、COCH和CELSR3升高，MGC17624和MTAP下降)，并基于此制作了分子進展風險評分表(MoPRS)來預測NMIBC的預后。該評分表在1個75例T1HG膀胱癌患者隊列中得到驗證，證明MoPRS是判斷T1HG膀胱癌患者病情進展的獨立預測因子。

2.1.5基因(57種)分類 WANG等[13]開發了1種基于57種基因、利用qPCR預測NMIBC進展風險的方法。他們通過比較已發表的膀胱癌微陣列數據集，確定了96個與侵襲性相關的基因，進而對96例膀胱腫瘤組織進行mRNA表達分析，最終篩選出57個基因(37個基因表達升高、20個基因表達降低)預測NMIBC(Ta和T1期)進展為MIBC的風險。上調基因主要以細胞粘附、細胞外機制入侵途徑、細胞周期調節和有絲分裂相關基因為主；低表達基因與低分化肺癌、浸潤性乳腺癌中的低表達基因重疊，同時p53、RB1等已知的抑癌基因也在下調基因之中。在該研究中，ACTN1和CDC25B首次在膀胱癌中被提到。免疫組化證實在膀胱癌中ACTN1以胞質表達為主，CDC25B以核表達為主。ACTN1在非侵襲性組和侵襲性組之間差異最明顯，CDC25B的表達隨疾病嚴重程度呈線性增加趨勢，這提示可以利用免疫組化的方法進行分類。該項研究匯集了之前的研究中最基本的基因，并促進了相關基因復雜相互作用的進一步研究。

2.1.6結合病理分期分級的基因分型 DESCOTES等[14]利用基因芯片對108例膀胱腫瘤進行分析，將T1期腫瘤分為病理T1a期和T1b期。首先根據腫瘤分期分級確定了322個探針的差異，相關基因主要與細胞周期基因高表達、免疫信號基因高表達和異源性代謝低表達相關。另外，進行組織學層次分類，驗證分子特征可以區分低級別(Ta低級別)和高級別腫瘤(T1b、T1a、Ta高級別)，高級別組主要與細胞周期基因高表達、免疫信號基因高表達、細胞發育相關基因高表達和異源性代謝低表達相關。利用qPCR在另一個膀胱腫瘤隊列中得到驗證，并確定了38個表達差異的基因。T1b期腫瘤的侵襲性比T1a期腫瘤強，更接近于MIBC，病理T1a期和T1b期二者之間存在明顯的基因標記差別。

2.1.7下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術的應用 以上所有這些研究都是基于微陣列技術進行的，現在轉錄組學領域已經被RNA測序所取代。最近的一項研究對23例高風險NMIBC患者進行了NGS，比較了膀胱內治療有反應的腫瘤和進展為MIBC的腫瘤基因組圖譜，尋找與高危NMIBC進展相關的新遺傳特征[15]。發現進展患者和非進展患者的DNA突變譜(TP53、PIK3CA、KMT2D、TERT的突變率)沒有差異，而CDKN2A和CDKN2B的突變和拷貝數變化可能是預測進展的生物標志物，這表明P53的缺失可能為膀胱癌進展的早期事件，而CDKN2A和CDKN2B的丟失可能是發生膀胱癌進展的一個重要步驟，這也支持了p16/P53/RB1信號參與高危NMIBC進展的觀點。

2.2 NIMBC分子分型的價值MIBC的治療主要關注患者生存期和對輔助治療的敏感性，NMIBC治療的關鍵在于判斷腫瘤復發和進展風險，從而選擇早期膀胱全切抑或膀胱灌注治療策略[3]。特別是對于T1G3膀胱癌，除了關注臨床病理因素，如腫瘤大小、多灶性、復發間隔、是否合并CIS、有無淋巴血管侵犯以及臨床亞分期[3]，還應確定其分子分型，從而判斷哪些患者發生進展的幾率更大。上述研究中的分子分型辦法給我們提供了參考，便于我們來選擇行早期胱切除術或避免膀胱切除，以減少手術并發癥發生及對生活質量的負面影響。

3 NMIBC分子分型的前景

雖然NMIBC分子分型的相關研究還比較少，但隨著測序技術不斷提升和成本降低，關于NMIBC分子分型的研究將越來越多，有助于加深在基因和分子層面對NMIBC的認識，從而更好地指導泌尿外科醫生治療患者，減少高風險患者腫瘤進展和致死的風險，低風險患者免去切除膀胱的痛苦。