浸種劑對(duì)水稻種子微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉元輝 徐春梅 陳松 褚光 章秀福 王丹英

（中國(guó)水稻研究所，杭州 310006；第一作者：liuyuanhui@caas.cn；*通訊作者：wangdanying@caas.cn）

水稻是世界上主要的農(nóng)作物之一，近一半人口以稻米為主食，其產(chǎn)量在維持全球糧食供應(yīng)方面起著核心作用[1]。目前，全球環(huán)境惡化及氣候變化等各種因素均增加了水稻病蟲害發(fā)生，威脅著全球糧食安全[2]。利用殺菌劑和殺蟲劑進(jìn)行種子處理，實(shí)現(xiàn)水稻早期病蟲害防治，對(duì)于減少農(nóng)藥使用量、保障水稻產(chǎn)量具有重要意義。種子處理是利用物理、化學(xué)和生物的方法和手段，主要包括浸種、拌種、種子包衣和種子丸?；?，為農(nóng)作物種子提供保護(hù)，促進(jìn)種子健康出苗。我國(guó)從20世紀(jì)50 年代就開始通過(guò)藥劑浸種、拌種來(lái)防治農(nóng)作物種傳病害[3-4]。咪酰胺為咪唑類廣譜殺菌劑，是一種高效、廣譜、低毒型殺菌劑，具有預(yù)防、保護(hù)、治療等多重作用；無(wú)內(nèi)吸作用，主要通過(guò)抑制麥角甾醇生物合成而起作用，對(duì)于子囊菌和半知菌引起的多種病害防效極佳。咪酰胺是水稻生產(chǎn)中常用的浸種劑，對(duì)水稻惡苗病、稻瘟病、紋枯病等具有良好的防治效果[5]。與此同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，咪酰胺浸種對(duì)水稻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)有抑制作用[6]。那么，咪酰胺在抑制種子表面病原菌生長(zhǎng)傳播的同時(shí)是否也抑制種子內(nèi)部有益微生物生長(zhǎng)？

目前，浸種劑的研究主要集中于對(duì)水稻種傳病害的防治、種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)等方面，其對(duì)水稻種子內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。因此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)和微生物分離培養(yǎng)，分析了咪酰胺浸種對(duì)水稻種子表面真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為咪酰胺在水稻上的安全利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為秀水134；供試藥劑為25%咪酰胺，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)清水浸種（CK）和咪酰胺浸種（Soak）兩個(gè)處理，每個(gè)處理5 次重復(fù)。選取0.5 g 均勻完整的水稻種子，用2 mL 0.1% 咪酰胺浸泡種子36 h，然后用無(wú)菌去離子水洗掉表面殘余咪酰胺，加入30 mL 10 mM MgCl2超聲震蕩3 h，吸取 1 mL 上述浸提液，依次以10倍稀釋梯度稀釋，取10-2~10-4濃度的菌懸液100 μL 涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，每個(gè)濃度涂5 個(gè)培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)，每隔24 h 觀察1 次，選取合適的稀釋濃度統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)以驗(yàn)證浸種劑對(duì)水稻表面真菌的影響。CK 用相同體積去離子水浸泡種子。為了研究浸種處理對(duì)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的影響，首先對(duì)種子進(jìn)行表面消毒，然后按照上述方法進(jìn)行咪酰胺浸種和清水浸種，提取不同處理的種子DNA，并進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增子測(cè)序及分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 水稻表面真菌菌落計(jì)數(shù)

統(tǒng)計(jì)種子表面菌懸液在孟加拉紅培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落數(shù)目，計(jì)算平均每1 g 種子表面真菌數(shù)目。真菌數(shù)目=（真菌數(shù)目×稀釋倍數(shù)）/種子質(zhì)量。

1.3.2 種子表面消毒方法

挑取0.5 g 均勻完整的水稻種子，用滅菌的去離子水清洗 2 次；75% 乙醇 2 min；表面消毒液（20% 次氯酸鈉、3% 氯化鈉、0.1% 碳酸鈉、0.15% 氫氧化鈉混合液）搖床（150 rpm 搖 12 min），倒掉液體；75% 乙醇 30 s，生理鹽水洗滌7 次。為了排除種子表面微生物，將最后一遍的清洗液吸取100 μL 涂布在TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.3.3 DNA 提取，16S rRNA 基因擴(kuò)增子測(cè)序及分析

各個(gè)處理的種子轉(zhuǎn)移至無(wú)菌研缽中，用無(wú)菌的1 mL 10 mM MgCl2溶液磨碎。種子勻漿按照Mabio 植物DNA 小量提取試劑盒B 所示方法提取每個(gè)樣品的基因組DNA，使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis 分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的濃度和純度。引物515 F（5‘-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3’） 和 806 R（5‘-GGACTA CVS GGG TAT CTA AT-3’） 被用于擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因的可變 V4 區(qū)。PCR 條件如下：94℃，5 min；94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min，30 個(gè)循環(huán)。使用Illumina 的NEBNext?UltraTMDNA 文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并添加index codes。使用Qubit @2.0 熒光計(jì)和Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。在Illumina_Hiseq 2500 平臺(tái)上對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并生成了長(zhǎng)度為250 bp 的配對(duì)末端讀段。使用USEARCH v.11.06[7]對(duì)序列進(jìn)行合并，修剪，過(guò)濾，比對(duì)和聚類后得到操作分類單位（OTU）。通過(guò)USEARCH 中的UPARSE-OTU 算法將具有≥97%相似性的序列分配給同一OTU。并使用VSEARCH 2.11[8]進(jìn)行嵌合體檢測(cè)后去除。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用R 中的phyloseq 軟件包（版本3.6.0）通過(guò)負(fù)二項(xiàng)式模型對(duì)生成的OTU 表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。主坐標(biāo)分析是利用Bray-Curtis 距離評(píng)估處理之間微生物群落的差異。為了計(jì)算β 多樣性的顯著性，在vegan 中使用函數(shù)adonis 進(jìn)行了置換多變量方差分析（PERMANOVA）。Shannon、Chao 1 和 Fisher 指數(shù)以及觀察到的物種數(shù)量是使用R 包vegan 中的功能多樣性計(jì)算的，并進(jìn)行了Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)以評(píng)估處理之間的差異。采用R 包 agricolae 進(jìn)行 Fisher 最低顯著性（LSD）檢驗(yàn)（p<0.05）。本研究中的所有數(shù)據(jù)均使用R 中g(shù)gplot2 和OriginPro 2017 生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪酰胺浸種對(duì)種子表面真菌的影響

選取稀釋倍數(shù)為1 000 倍平板統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，Soak 處理下水稻種子表面真菌的菌落數(shù)顯著降低，表明用咪酰胺浸種顯著抑制了水稻種子表面真菌的生長(zhǎng)。

2.2 咪酰胺浸種對(duì)種子內(nèi)細(xì)菌群落多樣性的影響

為了確定咪酰胺浸種是否影響水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提取不同處理種子DNA，并使用16S rRNA基因的擴(kuò)增子測(cè)序來(lái)研究微生物群落特征。經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾和嵌合體去除后，從10 個(gè)樣品中獲得537 146 個(gè)序列（平均每個(gè)樣品53 715 個(gè)），并以97%的序列相似性鑒定出1 646 個(gè)微生物OTU。使用Shannon、Chao1和Fisher 指數(shù)以及觀察到的OTU（豐富度）數(shù)量來(lái)評(píng)估微生物群落α 多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK 種子內(nèi)細(xì)菌群落α 多樣性略高于Soak 處理，但差異不顯著（圖2）。基于Bray-Curtis 距離對(duì)種子內(nèi)細(xì)菌群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析 （PCoA）和置換多變量方差分析（PERMANOVA），從圖3 可見(jiàn)，CK 和Soak 處理下水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落 β 多樣性差異不明顯（R2=12.54%，p=0.229）。

2.3 咪酰胺浸種對(duì)種子內(nèi)細(xì)菌群落組成的影響

分類學(xué)分析Soak 處理和CK 水稻種子內(nèi)占主導(dǎo)地位的細(xì)菌相對(duì)豐度的差異。如圖4 所示，在門分類水平下，相對(duì)豐度前20 的門在CK 和Soak 處理之間沒(méi)有顯著差異。其中，變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度在Soak 處理和CK 分別占水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落71.36%和70.75%；放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度分別占17.78% 和 20.10%；擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度分別占3.17% 和3.02%。在屬分類水平下，部分屬的相對(duì)豐度在Soak 處理的水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落占比更高，但是差異不顯著。比如黃單胞菌屬（Xanthomonas）的相對(duì)豐度在Soak 處理和CK 分別占9.63%和9.23%；假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對(duì)豐度分別占8.70%和5.82%；甲基桿菌屬（Methylobacterium）的相對(duì)豐度分別占8.54%和5.83%。同時(shí)，也有一些屬的相對(duì)豐度在CK 的水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落占比更高，差異不顯著。比如根瘤菌屬（Rhizobium）的相對(duì)豐度在Soak 處理和CK 下分別占水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落17.24%和 22.12%；泛菌屬（Pantoea） 的相對(duì)豐度分別占11.16%和 11.65%；細(xì)桿菌屬（Microbacterium）的相對(duì)豐度分別占8.51%和12.04%。

3 討論與結(jié)論

咪酰胺浸種通過(guò)抑制種子表面真菌的生長(zhǎng)從而實(shí)現(xiàn)防治種傳病害的目的，它對(duì)水稻惡苗病、稻曲病均有較好的防治效果[5，9-10]。況衛(wèi)剛等[11]采用菌株分離方法證實(shí)了咪酰胺對(duì)青稞種子攜帶真菌具有顯著抑制作用和消毒效果。這與本研究結(jié)果相吻合，咪酰胺浸種降低了水稻種子表面真菌數(shù)目。然而，咪酰胺浸種是一把雙刃劍，鄧接樓等[6]發(fā)現(xiàn)，咪酰胺浸種降低了雜交水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，并抑制了幼苗生長(zhǎng)。目前，咪酰胺浸種劑對(duì)種子內(nèi)細(xì)菌群落的多樣性及組成的研究較少。國(guó)際種子衛(wèi)生聯(lián)合會(huì)建立了一系列以種傳病原菌數(shù)量來(lái)評(píng)估種子質(zhì)量和純度的標(biāo)準(zhǔn)，各種植物檢疫措施，包括機(jī)械、熱、物理、生物和化學(xué)清洗種子的方法被廣泛使用[12]。并且，通常研究特定植物與微生物的相互作用時(shí)對(duì)種子進(jìn)行了表面消毒，以及分離培養(yǎng)種子微生物的挑戰(zhàn)導(dǎo)致科學(xué)家們長(zhǎng)期認(rèn)為種子內(nèi)是無(wú)菌的，萌發(fā)期幼苗的微生物主要來(lái)源于周圍環(huán)境，特別是土壤[13]。本研究利用16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析種子內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咪酰胺浸種處理對(duì)水稻種子內(nèi)部細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群比例沒(méi)有顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，咪酰胺浸種劑在抑制種子表面真菌的同時(shí)沒(méi)有影響內(nèi)部細(xì)菌群落，包括種子內(nèi)對(duì)植物生長(zhǎng)有益的細(xì)菌群落。這為我們科學(xué)合理使用咪酰胺浸種防治水稻病害提供了理論依據(jù)。