基于PCR技術擴增序列改造纖維素分解菌的教學設計

李 真 沈 璟

［對外經濟貿易大學附屬中學（北京市第九十四中學） 北京 100102］

高中生物學教學要求在真實情境中解決問題，培養學生的科學思維和科學探究能力，這要求教師在課程中向學生提供豐富的素材，包括實驗素材和科研素材，以及生產實踐中的具體應用，使學生既能運用知識解決問題，又能體會生物學科的價值。《普通高中生物學課程標準（2017年版）》，更強調學生的獲得，課堂的活動要有互動性、趣味性，凸顯學生的主體地位，有效提升課堂質量。

1 教材及學情分析

本節是拓展課程，內容涉及選修1 專題3 課題3 及專題5 課題2，具體包括：纖維素酶分解纖維素的原理、纖維素分解菌的初步篩選、PCR 的原理及應用。本節課以課題1 微生物的實驗室培養、課題2微生物的分離與計數、PCR 為技術基礎，以必修1的酶的作用和特點及必修2 的DNA 復制為理解的前提，又與選修3 現代生物科技專題緊密聯系。

學生具備酶的作用及特點的基礎知識，了解纖維素酶分解纖維素和PCR 的原理，但知識不夠系統化，尚不能前后聯系；通過親身的實驗操作，初步掌握PCR 技術，但對于如何設計PCR 引物獲得目的基因仍有一定困難，尤其是如何設計引物、改造DNA 片段；觀察到了日常生活中的現象，例如，落葉的分解、植食性動物對植物的消化，但不能將其與所學知識相聯系，并應用于生活、生產中。

2 教學目標

1）通過制備臨時裝片，在顯微鏡下觀察并比較破壁機、土壤中初步分離鑒定的纖維素分解菌、纖維素酶的破壁效果，從定性的角度明確纖維素酶的破壁效果最好，形成初步的實驗設想：利用生物技術對纖維素分解菌進行改造。

2）通過資料分析，了解原核生物和真核生物在表達纖維素酶方面的優、缺點，討論得出實驗設計，通過PCR 引物設計構建重組纖維素酶基因片段在原核生物中表達，培養與他人合作的意識及運用生物學術語敘述實驗方案的能力，培養科學思維。

3）通過分析真實的工業生產中纖維素酶轉化酵母菌的實例，體會生物學研究在生產實踐中的應用，感悟生物科學研究的價值。

3 重、難點及突破方法

1）重點：①明確實驗設計的一般思路和原則，單一變量、設置對照組；②描述實驗結果、概述實驗結論；③搭橋PCR 的引物設計。

2）難點：設計PCR 的引物獲得重組基因片段（搭橋PCR）。

3）突破方法：以實驗引入，激發學生興趣，通過展示不同處理后的實驗結果引起學生思考，分析實驗采用的單一變量（自變量）是處理的方式不同，因變量是破壁的效果，請學生描述實驗結果，說出實驗結論。為了高效獲得纖維素，最佳方法是酶解法，纖維素酶的制備選用什么方式更合理？出示大量的已有研究資料后，學生能提出采用細菌生產高效、經濟，需要解決的問題是要加入一段序列才能使纖維素酶向胞外分泌，從而引出本節課的難點，將2段序列拼接，需要通過PCR 的引物設計，人為創造重疊區域體外擴增。通過小組討論的形式，逐步引導學生加深思維力度；通過展示、糾錯、改正的過程，更高效地落實重點、突破難點。

4 教學過程

4.1 纖維素的重要性 纖維素 （C6H10O5）n是由葡萄糖組成的大分子多糖，是地球上最豐富的可再生資源。纖維素主要來源于植物界，包括棉花、木材、種植業廢棄物和禾草類植物，除了植物界，細菌和動物也可制造纖維素。據報道，每年全球大概會產生干重為1.3×1017t 的陸生植物，其中，纖維素占所有植物干重的50%。植物材料的主要成分除了半纖維素和木質素以外，就是纖維素，纖維素物質占地球總生物量的40%。若能將這些纖維素水解轉化為具有經濟潛力的生物多糖，不僅有利于環境保護，還可解決能源、糧食、環境等一些列問題［1］。提問：如何獲取植物細胞壁中的纖維素？

4.2 纖維素的獲取和結果分析 在教師引導下，結合生活經驗和前期篩選纖維素分解菌的經歷，學生提出可用物理（破壁機）、生物（纖維素分解菌、纖維素酶）方法破除細胞壁，獲得纖維素或將其水解。隨后，以小組為單位制備臨時裝片（圖1），觀察實驗結果，學生能得出結論：采用纖維素酶處理，水解最徹底、效果最佳，而用纖維素分解菌處理在相同時間內效果不佳，所以，利用植物中的纖維素需要提純獲得纖維酶。

圖1 不同處理后植物細胞情況

4.3 通過PCR 改造纖維素基因

資料1：纖維素是一種復合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，Reese 等（1950年）曾提出了C1-Cx 假說，該假說認為組成纖維素的不同酶需要協同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。一般情況下，C1酶首先進攻纖維素的非結晶區，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個葡萄糖［2］。

纖維素酶的來源非常廣泛，植物、昆蟲、軟體動物、原生動物、細菌、放線菌、真菌等都能產生纖維素酶，但是植物中的纖維素酶含量極低且難以提取，故目前纖維素酶的主要來源是微生物。

細菌培養周期短，抗污染能力強，成本相對低，但其產生纖維素酶的量相對較低，且大多不能分泌至細菌細胞外；主要產生的是C1酶，只有極少數細菌能分泌Cx 酶。真菌能產生3 類纖維素酶，但是分泌至菌體外的比例也較少,且會相互發生強烈的協同作用，酶的糖基化程度過高,還會影響酶的效率［3］。

任務：列舉細菌、真菌生產纖維素酶的優、缺點（表1）。

表1 細菌、真菌生產纖維素酶的優、缺點

為了提高產量、節約成本，應同時生產出3 種酶使其能協同發揮作用，學生提出設想將真菌編碼纖維素酶的基因轉入細菌體內表達，可提高產量節約成本、優勢互補，但這樣操作仍存在問題，即細菌產生的纖維素酶不向胞外分泌。

資料2：酵母表達系統具有將纖維素的最終產物——葡萄糖轉化為酒精的能力，如果能將纖維素酶的基因克隆至酵母中，可實現從纖維素到葡萄糖再到酒精的完整發酵過程。科研人員將瑞氏木霉纖維素基因（C1酶和Cx 酶）轉入釀酒酵母中表達，離心后取上清液，檢測重組酵母相對濾紙的酶活性，結果如圖2所示［4］。

圖2 重組酵母的相對濾紙酶活性

通過對資料2 的分析，學生能說出實驗結果：2組的相對濾紙酶活性高于對照組（1 組），3、4 組的相對濾紙酶活性顯著低于對照組，而3 組的相對濾紙酶活性又高于4 組。歸納實驗結論：C1酶和Cx 酶共轉化能提高相對濾紙酶活，3 組菌株中表達的Cx 酶很可能并未分泌至細胞外。

資料3：科研人員發現枯草芽孢桿菌也可產生纖維素C1酶。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌具有以下優勢：①在培養基中直接分泌蛋白并具有很強的分泌能力；②擁有一套高效分泌的信號肽系統，可高效地分泌目的蛋白；③是非致病性菌，無內毒素，具有臨床和環境方面的安全性。

枯草芽孢桿菌的強分泌能力與信號肽序列相關，位于信號肽序列下游的基因片段，表達的蛋白質可分泌至細胞外［3］（圖3）。

圖3 枯草芽孢桿菌信號肽序列［3］

任務：①利用PCR 技術應選擇引物________擴增枯草芽孢桿菌信號肽序列（表2）。

表2 引物名稱及序列

②根據資料2 和資料3 提供的信息，請你提出提高原料利用率且降低成本釀酒的方法。

通過上述活動，學生能選擇正確引物擴增目的基因片段，同時能提出需要將2 個片段相連接，人為設計一段中間重疊的區域，通過搭橋PCR 將信號肽片段和纖維素酶基因片段相連接。選擇2個小組進行展示匯報，將最終結果（圖4）呈現在黑板上，完善過程中其他小組提出質疑或答疑。

圖4 引物設計及PCR 擴增過程

4.4 板書設計（圖5）

圖5 板書設計

5 教學反思

本節課的設計將實驗和教學掛鉤，引導學生發現問題、解決思路，形成良好的科學思維，將前期的纖維素分解菌的分離和鑒定實驗與后續的PCR 實驗相串聯，巧妙銜接前、后知識。資料充分，既有學生的實驗結果，也有科研的數據，提高學生的參與感，充分落實了對學生生物學學科核心素養的培養，在基本知識的基礎上，培養學生的能力。整個課堂的呈現，學生參與度較高，教學設計對學生的思維訓練由淺入深，能滿足高階思維的要求。課堂反饋環節，教師指出本節課是針對現有問題提出的設想，在真實場景中能否實現還有待進一步的研究和科學的論證，這些都是學生在未來科研中可研究的方面。