綠鰭馬面鲀爛嘴癥致病菌的分離鑒定及藥敏試驗

英娜 王元 唐成婷 秦搏 楊立國 宋學鋒 郝志軍 高建民 吳艷慶

(1中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2平邑縣農業農村局，山東臨沂 273300；3煙臺海關技術中心，山東煙臺 264000)

綠鰭馬面鲀(Thamnaconusmodestus)隸屬于鲀形目(Tetraodontiformes)、單角鲀科(Monacanthidae)、馬面鲀屬(Thamnaconus)，又稱扒皮魚、耗兒魚等[1-2]。因其肉質鮮美，富含人體必需氨基酸及不飽和脂肪酸[3]而深受消費者的喜愛。近年來，隨著捕撈生產的加劇，野生綠鰭馬面鲀的資源量急劇下降。為了滿足市場需求，國內多地開展了綠鰭馬面鲀工廠化養殖。尤其2011年人工繁育技術突破以后[4]，綠鰭馬面鲀工廠化養殖產量越來越高。然而對于水產動物而言，養殖密度的加大也意味著患病風險的增加。

2019年夏季，江蘇連云港地區某養殖場發現有部分養殖綠鰭馬面鲀因嘴部皮膚潰爛、影響進食而死亡。鏡檢病灶及鰓、鰭部未發現寄生蟲，但是從病灶處分離出大量單一性狀的菌落。為確定病灶優勢菌的菌種信息，探明此菌與養殖綠鰭馬面鲀發病的關系，本研究進行了細菌分離鑒定工作，并針對此菌株開展了相關的藥敏試驗，以期為該病的治療及預防提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用綠鰭馬面鲀來自江蘇連云港某養殖場，為15個月齡魚。挑選典型的具有爛嘴、魚體偏瘦、體色發黑癥狀的瀕死魚作為試驗材料(見圖1)。Luria-Bertani培養基(LB培養基)、TCBS弧菌選擇性培養基購于青島海博生物有限公司；革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Mix 預混液購于生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司。

圖1 健康(a)與發病(b)綠鰭馬面鲀的嘴部Fig.1 The healthy(a)and diseased(b) mouth of T. modestus

1.2 組織處理和病原菌的純化

取瀕死病魚的嘴部潰爛組織，鏡檢觀察是否有寄生蟲。用75%酒精對潰爛組織進行表面消毒處理后，采用滅菌紙巾吸干表面水分。將以上組織剪碎、勻漿、稀釋處理，吸取100 μL勻漿稀釋液接種于直徑為90 mm的LB固體培養基上，置于28 ℃培養箱恒溫培養20 h后，將優勢菌落再次劃線分離培養，蘸取少量純化菌于載玻片上，經革蘭氏染色后進行顯微鏡觀察。

1.3 病原菌分子鑒定及序列分析

將再純化的菌落接種到LB液體培養基中，搖菌16～20 h(恒溫搖床：28 ℃，150 r/min)。并將一部分菌液加入甘油凍存留種，另一部分菌液離心清洗后，按照DNA提取試劑盒說明書的流程進行基因組DNA的提取。使用16S rRNA基因通用引物進行PCR核酸擴增，通用引物序列為：27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應體系為25 μL(包括1 μL DNA 模板，12.5 μL 2×TaqPCR Mix，10.5 μL ddH2O，上、下游引物各0.5 μL)。反應條件為：94 ℃預變性5 min，然后進行35個循環的擴增程序(94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s)，最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產物用于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將擴增出目標條帶(1 500 bp左右)的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結果提交至National Center for Biotechnology Information(NCBI)，并進行BLAST(basic local alignment search tool)比較，選取比對結果中相似性排名前10的序列作為待測菌株參考，通過鄰接法(neighbour-joining，NJ)構建目標菌株與相似性序列的系統進化樹。

1.4 人工回感試驗

選擇健康綠鰭馬面鲀(15個月齡左右，體長8.2～10.4 cm)為感染對象。將甘油冷凍保存的目標菌株進行LB液體培養基活化培養，并制備一系列濃度梯度稀釋的菌懸液，注射到健康魚體內，注射量為200 μL/尾，并以同樣體積的生理鹽水作為對照組注射液。注射后的綠鰭馬面鲀分別飼養于流水(日換水量為200%)、充氣的玻璃鋼魚缸內，水溫約為18 ℃。1周后統計試驗用魚的癥狀率和死亡率。

1.5 藥物敏感性試驗

選取不同類型抗生素的代表藥物進行藥敏試驗。取100 μL處于對數生長期的菌液均勻涂抹到LB平板上，晾干后，分別取不同藥敏片置于平板上，倒扣放置。24 h后統計不同藥物抑菌圈的大小，并以抗菌藥物敏感試驗標準來判斷其敏感性。

2 結果

2.1 病原菌觀察及分子鑒定結果

將病灶組織分離出的優勢菌命名為QZG3。此菌株在TCBS選擇培養基上的形態為：綠色，圓形，黏稠狀(見圖2)，在顯微鏡下可觀察到QZG3菌株形狀短小，長度0.8～2.1 μm；經革蘭氏染色，判斷QZG3菌株為革蘭氏陰性菌。同時QZG3菌株的16S rDNA序列經NCBI數據庫的BLAST比對，結果表明，此菌株與弧菌屬相似性達99%～100%。系統進化樹分析結果表明，該菌株與阿爾法克弧菌(Vibrioalfacsensis)聚為1支(見圖3)，因此判斷該菌株為阿爾法克弧菌。

圖2 病原菌的形態觀察Fig.2 Morphological observation of pathogenic bacteria

2.2 人工回感試驗結果

QZG3菌株對健康綠鰭馬面鲀的人工回感試驗結果見表1(統計周期為7 d)。注射QZG3菌株組綠鰭馬面鲀的累計死亡率為10%～30%，出現癥狀率為30%～90%，對照組(注射生理鹽水)則未出現死亡情況和爛嘴癥狀。從感染再發病魚的組織中分離出的優勢菌株與QZG3表面形態一致，因此推斷QZG3菌株為綠鰭馬面鲀爛嘴癥的致病菌株。

表1 不同濃度的QZG3菌株對綠鰭馬面鲀的毒力測定結果Tab.1 Toxicity test results of different concentrations of QZG3 strains to T. modestus

2.3 藥敏試驗

QZG3菌株對10種抗生素的敏感性結果見表2。結果表明，QZG3菌株對恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對土霉素、青霉素、頭孢氨芐、慶大霉素、卡那霉素、四環素和紅霉素表現出耐藥性，對新霉素中度敏感。

表2 菌株QZG3的藥敏特性Tab.2 Drug sensitivity of strain QZG3

3 討論

皮膚潰爛是常見的養殖魚類細菌性疾病之一，主要表現為爛嘴、爛尾、爛鰭等癥狀，其中爛嘴癥不容小覷。患輕度爛嘴癥的個體由于影響正常攝食而出現體形消瘦、腸炎等癥狀，嚴重患病個體則會出現體表大面積潰爛，甚至病原菌從傷口進入血液從而引發菌血癥。魚類皮膚潰爛大多由弧菌[5-6]或者氣單胞菌[7]引起。弧菌是水產養殖生產中常見的致病菌，如引起凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死綜合征的副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)[8-9]、引起赤魚工皮膚潰爛的創傷弧菌(V.vulnificus)[5]、引起林蛙爛嘴病的解藻朊酸弧菌(V.alginolyticus)[10]等。夏季水溫較高，正是弧菌疾病的高發期。

注：括號中為菌株的GenBank登錄號。Note:the GenBank login number of the strain is in parentheses.圖3 通過鄰接法構建的基于菌株QZG3及相關菌株16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of strain QZG3 and related bacteria was constructed by Neighbor-joining method

本研究發現，綠鰭馬面鲀爛嘴癥的致病菌為阿爾法克弧菌。此前未見相關的研究報道，這可能與此菌的宿主特異性有關。另一方面，國內關于綠鰭馬面鲀的研究集中在養殖[11-12]、繁育[13]等方面，對細菌性疾病的研究相對較少。

目前我國水產養殖業存在因長期、過量使用抗生素而導致細菌耐藥性增加、水產品中抗生素殘留超標和養殖環境中抗生素污染等問題，已嚴重影響我國水產養殖業的健康發展[14]。本研究藥敏試驗結果表明，綠鰭馬面鲀爛嘴癥的致病菌——阿爾法克弧菌已經對土霉素、青霉素、紅霉素、頭孢氨芐、慶大霉素、卡那霉素、四環素等表現出耐藥性，說明養殖生產過程中存在使用抗生素不規范現象。因此，在今后的養殖生產過程中，應該科學、規范地使用抗生素，非必須情況下避免使用，必須情況下也應該避免長期或者過量使用同一種抗生素。