幽門螺桿菌的免疫學檢測技術及其主要抗原表位

景榮先,劉昆梅,徐鎧琳,邢以文,薛 滿,湯 鋒,郭 樂*,張國林*

(1.南京醫科大學附屬蘇州醫院(蘇州市立醫院)藥學部，蘇州 215000；2.寧夏醫科大學，銀川 750021；3.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215000；4.青海大學，西寧 810001)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是定植于胃和十二指腸的微需氧、革蘭陰性螺旋彎曲菌，是慢性胃炎、消化性胃潰瘍和胃癌的重要致病因子。國際癌癥機構已將H.pylori定義為胃癌的Ⅰ類致癌物。在世界范圍內，H.pylori的感染率超過50%，我國67%～80%的胃潰瘍和95%的十二指腸潰瘍是由H.pylori感染引起的[1]。臨床治療H.pylori感染性胃病主要采用多聯抗生素療法，但抗生素導致的H.pylori耐藥性、治療后復發感染和破壞腸道微生態平衡、藥物毒性和不良反應等局限性使其應用受到較大限制。基于多種抗原(或抗體)的組合表位同時具備了高靈敏度和高特異性的優點，其在H.pylori診斷和疫苗及抗體等生物技術藥物開發方面具有廣闊的前景。

H.pylori感染的檢測可基于胃黏膜活檢組織、呼氣標本、胃液、血清、尿液及糞便等多種標本進行?？焖倌蛩孛冈囼?RUT)檢測H.pylori感染需要取胃竇和胃體等胃部組織，受試劑pH值、取材部位、組織大小、細菌量和環境溫度等因素影響較大；胃組織學檢測因不同染色方法而呈現的檢測結果存在較大的差異性；培養法檢測H.pylori感染，操作復雜、耗時，且標本轉送培養需專門的轉送液并保持低溫；尿素呼氣試驗(UBT)檢測H.pylori，準確性高，易于操作，可反映全胃H.pylori感染狀況，克服因細菌呈“灶性”分布而造成的假陰性。但UBT檢測值處于臨界值附近時，結果不可靠。免疫學技術的發展和菌體表面關鍵抗原為免疫學檢測H.pylori感染奠定了基礎。

1 H.pylori的免疫學檢測

隨著單克隆抗體制備與純化工藝研究的不斷深入，基于抗原-抗體反應的H.pylori檢測技術取得了突破性進展。酶聯免疫吸附(ELISA)測定法、膠體金免疫分析法、免疫印跡法和蛋白質芯片分析法等[2]都在分析H.pylori感染方面取得了較大的進步。

膠體金免疫分析法是繼酶、熒光素和同位素標記后的又一免疫標記技術，且在生物醫學領域得到了廣泛的應用。膠體金免疫層析、免疫金滲濾法、快速免疫測試卡和金標試紙條法是H.pylori檢測的主流方法?；谀z體金檢測技術的H.pylori抗體(或抗原)檢測也具有較高的靈敏度和特異性，適合于H.pylori感染的大規模流行病學篩查。目前已有基于膠體金技術的H.pylori診斷試劑盒產品獲國家藥監局批準，本課題組也在開展基于H.pylori多重關鍵抗體的檢測試劑的開發。

ELISA測定是將特定的抗原或抗體吸附于固定相表面，加入待檢測的抗體或抗原與之反應，再加入標記的二次抗原或抗體待測抗體或抗原反應，最終根據顯色情況進行分析的方法。ELISA檢測H.pylori抗體(或抗原)具有靈敏度高和特異性強的優點，且操作簡便、檢測速度快，適合于糞便、尿液、血液或唾液等樣本的分析?；贓LISA測定的H.pylori檢測適合于大規模的流行病學篩查。

免疫印跡法是將H.pylori中的蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移至纖維素膜上后，用相應的抗體進行免疫雜交后顯色來判斷H.pylori的感染情況。免疫印跡法可用于H.pylori的檢測，且靈敏度高，特異性強，無創，但操作相對復雜，不適合大規模的流行病學篩查。

蛋白質芯片分析法是將H.pylori抗原包被后固定于固相膜上，將待測樣本在固相膜上發生抗原抗體反應實現樣本的檢測。蛋白質芯片檢測H.pylori可實現高通量檢測，適合于流行病學檢測。目前已有包被空泡毒素相關蛋白A(VacA)、細胞毒素相關蛋白A(CagA)、熱休克蛋白60(Hsp60)、尿素酶(Ure)和氧不敏感的 NADPH 硝基還原酶(RdxA)等抗原的H.pylori檢測用芯片。

H.pylori特異性抗原或關鍵抗原是基于免疫反應的H.pylori檢測的關鍵，也是H.pylori疫苗開發的基礎。通常情況下，理想的抗原應具有高免疫原性、高特異性、易制備、易儲存、穩定性好等特點。Ure、細胞毒素相關蛋白A/L(CagA/L)、VacA和中性粒細胞激活蛋白(NAP)是H.pylori致病性的關鍵表面抗原，也是目前診斷試劑和疫苗開發的基礎。采用原核表達制備上述抗原具有理想抗原的特點，適合于診斷產品的開發。

2 H.pylori的毒力蛋白抗原與應用

2.1Ure Ure為含有鎳離子的金屬酶，是H.pylori中含量最高的蛋白，占菌體可溶性蛋白的5%～10%[3]。Ure的結構亞單位有尿素酶A(UreA)和尿素酶B(UreB)，其中UreB為Ure的活性亞基，相對分子質量較大，具有高度的序列保守性和免疫原性。基于UreB活性的RUT及UBT是臨床診斷H.pylori感染的重要手段。UreB也是開發H.pylori疫苗的最佳候選抗原。

Ure是H.pylori感染診斷的重要分子基礎。RUT是基于H.pylori產生的Ure可分解尿素產生NH3和CO2，而前者可使胃黏膜組織pH值升高。通過肉眼觀察pH指示劑顏色的變化可判斷是否有H.pylori感染。RUT試劑成本低、檢測速度快、靈敏度較高，但其必須依賴胃鏡檢查，屬于侵入性的檢查手段。UBT是基于同位素標記的尿素可被H.pylori產生的Ure分解產生CO2，通過CO2中的碳同位素來判斷胃部H.pylori的感染情況。UBT的同位素標記可采用13C或14C標記。UBT屬于非侵入性診斷手段，但檢測過程中使用的閃爍液具有一定的輻射性，不宜對兒童或孕婦進行檢測。

Ure是亞單位疫苗和表位疫苗重要的分子基礎。亞單位疫苗也稱組分疫苗，是近年來疫苗研究領域的重點，是通過提取微生物的特殊蛋白結構，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗[4]。UreB亞單位不具有Ure的全酶活性，但具有無毒性和高免疫原性，是目前研究最廣泛的H.pylori疫苗抗原[5]。UreB基因在不同菌株之間具有高度的序列保守性，呈現出較高的免疫原性的穩定性。雖然從H.pylori菌體中直接分離到的UreB數量較少，但通過基因重組與原核表達制備UreB技術的成熟為特異性UreB疫苗設計和開發奠定了基礎。表位疫苗是利用基因工程的手段，通過人工合成或體外表達病原體表位，并將其作為疫苗使用。UreB蛋白是由569個氨基酸構成的大分子，將整個蛋白作為疫苗抗原存在成分復雜、特異性低和免疫應答弱的局限性，而探索UreB蛋白中激發機體免疫應答的免疫保護性優勢抗原表位作為抗原具有較高的價值。目前UreB蛋白的B細胞表位已經得到了深入的研究。在分析UreB亞單位免疫小鼠的模型時發現有2個確定的UreB表位具有保護性：UreB373-385和UreB317-329，且佐劑和疫苗接種途徑會影響T細胞對抗原表位的反應[6]。將霍亂毒素B亞單位(CTB)、H.pylori尿素酶Ⅰ亞單位(UreI20-29，UreI98-107)和H.pyloriUreB亞單位的4個抗原片段(UreB12-23，UreB229-251，UreB327-400和UreB515-561)連接起來，構建的多表位疫苗CTB-UreI-UreB(BIB)免疫BALB/c小鼠后發現小鼠對H.pylori攻擊有顯著的抵抗作用，而單獨用佐劑重組霍亂毒素B亞單位(rCTB)或PBS免疫小鼠均未發現保護作用，提示BIB多表位疫苗是有潛力的候選疫苗[7]。用重組Hp尿素酶B亞單位(rUreB)接種BALB/c小鼠可產生顯著的抗原特異性Th1和Th17免疫應答，在免疫小鼠中發現了UreB317-329和UreB409-421 2個新的Th表位，二者可被大量CD4+T細胞識別，且可通過誘導Th1淋巴細胞介導對H.pylori的保護作用[8]。包含Ure基因的H.pylori多價表位疫苗CWAE具有科學合理的抗原結構，具有激發BALB/c小鼠產生H.pylori特異性抗體體液免疫和淋巴細胞免疫應答的作用[9]。同時，口服H.pylori多價表位疫苗CTB-Hap A-UreA-UreB-CagA (CTB-HUUC)后，BABL/c小鼠體內Ure試驗陽性率明顯降低，對H.pylori感染的預防效果明顯[10]，且口服CTB-HUUC多價表位疫苗也能有效治療H.pylori對BABL/c小鼠的感染。但應當指出的是，不同途徑、不同劑量的UreB抗原對高效價H.pyloriUreB亞單位重組蛋白免疫血清的產量和活性有重要影響[11]。

2.2細胞毒素相關蛋白 CagA/L是由CagA致病島基因編碼的親水性外膜蛋白，相對分子質量為120～140 kDa，具有強免疫原性。CagA蛋白羧基端具有5個重復氨基酸基序(EPIYA基序)，且基于EPIYA基序，H.pylori可分為東亞型和西方型。CagA通過依賴或不依賴酪氨酸磷酸化調控細胞增殖和分化，并能夠引起胃上皮細胞發生轉化而誘發癌變。CagA蛋白依據蛋白大小可分為A、B、C和D型，其一方面可刺激產生生長因子誘發癌變，另一方面也可誘導細胞生長抑制劑P21活性。CagA蛋白也是H.pylori引起炎癥反應的效應分子，CagA陽性(CagA+)H.pylori誘發胃癌風險是CagA陰性(CagA-)H.pylori的7.4倍。

CagA與H.pylori感染密切相關，是H.pylori感染診斷的重要標志物，且CagA+H.pylori感染是結直腸腺瘤的危險因素。H.pylori感染是結直腸腺瘤的重要致病因子，CagA+H.pylori感染可能通過促進患者血清炎癥因子及胃泌素水平參與慢性胃炎患者胃黏膜一系列病理改變的發生和進展過程[12]，且CagA+H.pylori感染可通過促進患者血清炎癥因子及胃泌素刺激結直腸腺瘤細胞的異常增殖、分化，進而引起結直腸腺瘤[13]。UBT聯合CagA、VacA、UreA和UreB等抗體分型有助于診斷H.pylori感染[14]。運用蛋白芯片技術檢測H.pylori抗體、CagA、VacA和Ure的分型有助于臨床H.pylori感染的明確診斷和H.pylori的根除率[15]。同時，H.pylori的感染與患者的CagA基因表達呈顯著相關性，且CagA聯合VacA可提高H.pylori感染診斷的靈敏度與準確性[16-17]。

CagA蛋白是H.pylori感染的生物標志物，具有較好的免疫原性，是開發H.pylori預防性疫苗和治療性疫苗的良好抗原[18]。用3種重組H.pylori抗原VacA、CagA和NAP組成的疫苗免疫原性強，進行肌肉免疫后可預防H.pylori感染，健康成人耐受性好[19]。治療性疫苗接種是控制H.pylori感染的理想選擇。以不同方式表達H.pyloriCagA、VacA和UreB融合蛋白的減毒沙門氏菌載體疫苗對H.pylori感染的治療效果與融合蛋白的排列有關，且有望成為抗H.pylori的候選疫苗[20]。慢性感染H.pylori病原體會導致胃炎和胃潰瘍，并使攜帶者更容易患胃癌[21]，而H.pylori特異性疫苗接種是一種有廣泛前途的胃癌預防策略。CagA+H.pylori感染可引起小鼠CD4+T細胞反應，而黏膜或腸外接種重組CagA可顯著增強CD4+T細胞反應。將CagA特異性T細胞過繼轉移到T細胞缺陷、H.pylori感染的受體中，足以誘導癌前免疫病理學的全面發生。用霍亂毒素佐劑的CagA+全細胞超聲疫苗免疫小鼠，可使其對H.pylori相關胃癌前體病變敏感[22]。

細胞毒素相關蛋白L(CagL)為H.pyloriⅣ型分泌系統(TFSS)菌毛結構表面蛋白，屬于H.pylori的伴侶蛋白，發揮連接TFSS與靶細胞的特異性黏附作用。H.pyloriCagL氨基酸多態性與消化性潰瘍及胃癌的發生有關，D58位點GG、AG基因型與E59位點AA、AG基因型可增加胃癌的發病風險[23]。H.pylori重組抗原表位肽C-CagA/L能特異性識別CagA和CagL，具有預防H.pylori感染的免疫潛力[24]?；贑agL雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法基本滿足敏感性高、特異性強、穩定性好的特點，建立的試劑盒批內重復和批間重復性均較好，批內變異系數在1.65%～10.5%之間，批間變異系數在1.3%～9.35%之間[25]。

2.3VacA VacA為相對分子質量為88 kDa的蛋白，幾乎存在于所有的H.pylori菌株中。VacA具有多種生物學活性，可誘導細胞空泡樣變性和致細胞凋亡，也可通過多種信號通路發揮細胞毒作用，損傷機體。胃潰瘍、萎縮性胃炎的VacA基因表達率明顯高于淺表性胃炎，VacA相對表達量可作為淺表性胃炎、萎縮性胃炎的指標[26]，且H.pylori毒力基因CagA、VacA和IceA與胃十二指腸疾病的發生及惡化密切相關[27]。H.pylori空泡毒素VacA可促進胃上皮細胞NLRP3炎性小體激活[28]，且VacA基因可能與H.pylori對克拉霉素產生耐藥性相關[29]。口服抗VacA-免疫球蛋白Y(IgY)對H.pylori定植有保護作用，并能誘導胃組織發生組織學改變，且VacA-IgY有望成為治療H.pylori感染的新藥候選藥物[30]。

VacA是H.pylori關鍵抗原之一，是判定H.pylori感染和開發H.pylori疫苗的關鍵蛋白。H.pylori重組空泡細胞毒素(rVacA)保留天然構象表位，可作為抗H.pylori治療的疫苗抗原：具有構象表位的rVacA抗原具有潛在的疫苗成分，可用于血清學和組織病理學分析[31]。空泡性細胞毒素A作為H.pylori分泌的主要毒素之一，能誘導胃細胞胞漿內形成“空泡”樣的膜小泡。VacA具有破壞線粒體功能、刺激細胞凋亡、阻斷T細胞增殖、促進調節性T細胞增殖等作用，是一種很有前途的疫苗靶點，且已被評估為疫苗抗原[32]。在利用釀酒酵母表面展示技術篩選H.pylori候選疫苗時證實VacA抗原蛋白可成功在S.cerevisiaeEBY100表面展示，小鼠經口服免疫S.cerevisiaeEBY100/p YD1-VacA后可誘導產生較高的VacA特異性抗體，提示VacA可作為H.pylori疫苗開發的潛在抗原[33]。VacA毒素在臨床表現上具有很高的效價，有助于H.pylori的持續和定植，因此被認為是生產疫苗和單克隆抗體(mAb)的關鍵成分之一[34]。

治療性疫苗接種是控制H.pylori感染的理想選擇，而VacA是開發口服疫苗的關鍵蛋白之一。表達融合蛋白CVU(CagA、VacA和UreB融合蛋白)的減毒沙門氏菌口服治療性免疫可顯著降低H.pylori在胃中的定植；融合蛋白的保護作用與特異性CD4+T細胞Th1型反應、血清免疫球蛋白G(IgG)和黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)抗體反應有關，表明表達融合蛋白CVU的減毒沙門氏菌載體疫苗優于其他疫苗，有望成為抗H.pylori的候選疫苗[20]。

2.4NAP NAP位于H.pylori體內，是鐵蛋白的一種，能激活中性粒細胞釋放活性氧簇。有證據顯示過氧化狀態與胃癌的發生過程密切相關[35]。NAP蛋白是H.pylori的重要毒力因子，與H.pylori的高致病性密切相關，NAP蛋白可通過自溶釋放引起中性粒細胞和單核細胞向胃黏膜浸潤，導致胃黏膜驗證損傷，也可通過誘導中性粒細胞釋放還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶等導致大量活性氧中間產物的釋放，并攻擊宿主細胞DNA分子誘導突變。

NAP具有很強的免疫原性，可用于H.pylori疫苗的開發。NAP在H.pylori疫苗開發方面有巨大的潛力，載體介導的H.pyloriNAP是疫苗研制的重要候選分子[36]。具有穩定基因型和表型的鼠傷寒沙門菌是重組多價疫苗的表達載體，如伴芳香族氨基酸基因缺失的營養缺陷型突變株以及伴腺苷酸環化酶、腺苷酸環化酶(cAMP)受體蛋白和天冬氨酸β半醛脫氫酶基因缺失營養缺陷突變株等。在分析表達H.pyloriNAP的減毒沙門疫苗菌對人類H.pylori感染的小鼠模型的免疫保護作用時證實重組疫苗菌對H.pylori感染小鼠具有一定免疫預防作用，可作為多組分重組減毒沙門疫苗菌的侯選菌株之一[37]。除沙門菌外，乳酸菌也是表達中性粒細胞激活蛋白A(NapA)疫苗的潛在載體。表達H.pyloriNapA的重組乳酸乳球菌菌株為研究NapA作為疫苗抗原和免疫調節劑的應用奠定了物質基礎，擴增的NapA基因構建的重組乳酸乳球菌經乳鏈菌肽(nisin)誘導可表達相對分子質量為19 kD的重組蛋白，該重組蛋白可被小鼠抗H.pylori血清識別，具有口服疫苗和黏膜免疫調節的應用潛力[38]。表達NAP蛋白的乳酸菌免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產生特異的IgG和免疫球蛋白A(IgA)，提示乳酸菌可作為抗原遞送載體，且為基于NAP蛋白的H.pylori口服疫苗的開發奠定了一定的實驗基礎[39]。表面表達H.pyloriNAP蛋白的重組枯草芽孢桿菌具有較強的免疫性，免疫小鼠15 d后NAP特異性IgG升高即達高峰[40]。表位疫苗是治療性H.pylori感染的有效疫苗。含有H.pylori各種抗原的多價亞單位疫苗優于單價亞單位疫苗。然而，多價表位疫苗在治療性H.pylori疫苗中是否優于單價表位疫苗尚存在爭議。研究顯示，H.pyloriUre、NAP、熱休克蛋白60(HSP60)和H.pylori黏附素a(HpaA)的多價表位疫苗能誘導抗H.pyloriUre特異性抗體，提示基于多價表位的H.pylori抗原表位和B細胞表位的多價表位疫苗可能是一種有前途的抗H.pylori感染的候選疫苗[41]。利用H.pyloriNAP的佐劑活性，可有效誘導T細胞的活化和增殖，提高樹突狀細胞疫苗的免疫效果[42]。

3 小結

H.pylori是危害人類健康的常見病原體。對感染H.pylori的診斷是治療和判斷預后的前提。近年來，ELISA測定法、膠體金免疫分析法、免疫印跡法和蛋白質芯片分析法等都在H.pylori感染分析方面取得了較大的進步。H.pylori特異性抗原或關鍵抗原是免疫反應檢測H.pylori的關鍵，也是開發H.pylori疫苗的基礎。Ure、CagA/L、VacA、NAP等是H.pylori致病性的關鍵表面抗原，具有高免疫原性、高特異性、易制備、易儲存和穩定性好等特點，是目前H.pylori診斷試劑和疫苗開發的基礎。同時檢測H.pylori的多種抗原/抗體可明顯提高檢測的靈敏度，而針對性分析抗原/抗體關鍵表位可以提高檢測的特異性。構建多重抗原(或抗體)表位的表達載體是實現這一目的的有效途徑。本課題組通過設計多重抗原/抗體表位的表達載體開展了基于膠體金免疫技術的H.pylori診斷試劑盒開發研究，取得了較好的結果。應當指出的是，采用原核表達多重抗原/抗體蛋白的合成速率、蛋白的折疊率、肽鏈聚集的速率是影響診斷試劑和生物技術藥物開發的關鍵因素，尤其是可溶性蛋白的折疊結構和免疫原性。