分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物上的應(yīng)用現(xiàn)狀與金錢(qián)草的研究進(jìn)展

鄭子洪， 周曼佳， 何祥玉， 羅佳雯， 程汝濱*

(1.浙江九龍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心， 浙江 遂昌 323300； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 浙江 杭州 310053)

藥用植物種質(zhì)資源是保障其可持續(xù)發(fā)展的核心，也是中醫(yī)藥發(fā)展的基礎(chǔ)，但是隨著社會(huì)需求的迅速增長(zhǎng)，導(dǎo)致藥用植物資源過(guò)度消耗，同時(shí)市場(chǎng)上也存在許多混偽品摻雜的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響藥用植物的臨床用藥效果。因此，尋找高效穩(wěn)定的方法，對(duì)藥用植物及其混偽品進(jìn)行鑒別，以推動(dòng)藥用植物的可持續(xù)發(fā)展需求迫切。分子標(biāo)記技術(shù)作為一項(xiàng)速度快、特異性強(qiáng)和靈敏度高的技術(shù)，可快速準(zhǔn)確地鑒別植物品種及促進(jìn)其系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的深入研究。ZHOU等[1]基于掌葉大黃、藥用大黃和唐古特大黃的葉綠體基因組開(kāi)發(fā)出潛在DNA條形碼并成功驗(yàn)證，為超級(jí)DNA條形碼在大黃中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。植物葉綠體基因組全序列具有獨(dú)特的高度保守結(jié)構(gòu)，因其堿基替換率低、單親本遺傳特性使其在植物的系統(tǒng)分類、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析中具有特殊的優(yōu)勢(shì)。CHEN等[2]研究表明，6種橐吾屬植物的全基因組可能成為有效鑒定其物種的超級(jí)條形碼。金錢(qián)草為植物過(guò)路黃的干燥全草，具有清熱解毒，利尿排石，活血散瘀之功效，可治療肝膽結(jié)石、膽囊炎和水腫等。目前，藥材市場(chǎng)上的藥材品種繁多，同名異物等現(xiàn)象導(dǎo)致其質(zhì)量不高，各物種原植物形態(tài)、藥材性狀方面極為相似，近緣混偽品較多、真?zhèn)坞y辨，造成藥材質(zhì)量不穩(wěn)定。為同類研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)，概述了DNA條形碼、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)等方面概述了分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物研究上的應(yīng)用及金錢(qián)草的地方習(xí)用品與市場(chǎng)混用品、化學(xué)成分和藥理作用等的研究進(jìn)展，并展望了其未來(lái)的研究方向。

1分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物上的應(yīng)用現(xiàn)狀

DNA分子標(biāo)記具有分布范圍廣、標(biāo)記數(shù)量多、性狀穩(wěn)定且選擇便利、操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于藥用植物的分析鑒定。目前，分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)藥用植物研究提供了技術(shù)保證，其種類已有10余種，如DNA條形碼、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)等，給藥用植物研究提供技術(shù)保證。而葉綠體基因序列具有獨(dú)特的高度保守結(jié)構(gòu)，比傳統(tǒng)的DNA條形碼具有更強(qiáng)的分辨力和更好的通用性，具備成為物種鑒定超級(jí)條形碼的潛力。

1.1DNA條形碼

DNA條形碼(DNA barcoding)是通過(guò)利用一段短的、較保守的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列進(jìn)行物種鑒定的分子技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、能快速準(zhǔn)確鑒別大量樣本、結(jié)果不受外界環(huán)境影響等，實(shí)現(xiàn)藥用植物的快速準(zhǔn)確鑒定，推動(dòng)了DNA條形碼技術(shù)在藥用植物方面的應(yīng)用，是藥用植物分子鑒定方法上的重大創(chuàng)新[3]。近年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)在藥用植物各方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。INTHARUKSA等[4]研究發(fā)現(xiàn)，條形碼基因rbcL、ITS、ITS1和ITS2與psbA-trnH的組合可以準(zhǔn)確區(qū)分不同的訶子屬藥用植物，且ITS2與psbA-trnH的DNA條形碼組合鑒別效果最好。張宏意等[5]研究發(fā)現(xiàn)，psbA-trnH序列分析可從分子水平上對(duì)德慶道地種源何首烏與其他種源何首烏進(jìn)行有效鑒定和區(qū)分。JIN等[6]對(duì)400種蘭科植物DNA序列分析并結(jié)合聚類分析結(jié)果表明， rbcL可單獨(dú)或結(jié)合其他基因片段用于蘭科植物的遺傳多樣性研究，且蘭科植物的遺傳多樣性豐富。

1.2限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)是一種以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記。該技術(shù)由于等位基因呈共顯性，且標(biāo)記數(shù)量多和穩(wěn)定性高，已廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定和親緣關(guān)系分析等。梁晉軍等[7]對(duì)柿及其親緣植物關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，柿與金棗柿的親緣關(guān)系最緣，與美洲柿和烏柿的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。SHI等[8]基于105種白頭翁屬植物和其常見(jiàn)摻假物的植物樣品，建立ITS2條碼庫(kù)，并開(kāi)發(fā)出快速特異性PCR-RFLP鑒定檢測(cè)方法，為快速鑒別市售白頭翁產(chǎn)品提供技術(shù)支撐，有助于保證其中藥產(chǎn)品的安全使用。

1.3擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)是RFLP和PCR技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，其特點(diǎn)是在知道DNA信息的條件下，專用引物能準(zhǔn)確地對(duì)酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AFLP具有分辨率高、穩(wěn)定性好且靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)可用于亞種分化和種間關(guān)系的研究。劉曉瑩等[9]對(duì)212個(gè)廣藿香樣本進(jìn)行AFLP分析顯示，廣藿香種間具有較為豐富的遺傳多樣性，種內(nèi)遺傳多樣性相對(duì)較小，種間遺傳分化顯著，可為廣藿香優(yōu)良種質(zhì)的篩選等研究提供參考依據(jù)。蘇增一等[10]對(duì)不同產(chǎn)地益智樣本進(jìn)行AFLP-PCR擴(kuò)增，篩選出4對(duì)適合于益智AFLP分析的引物，且E3/M7引物組合效果最佳，能夠鑒定不同產(chǎn)地益智的種質(zhì)資源。

1.4單核苷酸多態(tài)性(SNP)

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)主要指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，這是一種檢測(cè)遺傳多樣性和保護(hù)育種者權(quán)利的有用的基因分型工具，可用于藥用植物的道地性評(píng)價(jià)，有望成為最有效的分子標(biāo)記技術(shù)。喬?hào)|亞等[11]以85份紫薇種質(zhì)為樣本材料進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，篩選出高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，獲得SNP分型數(shù)據(jù)，紫薇種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，不同類群間存在較高的基因流。WANG等[12]通過(guò)檢測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)設(shè)計(jì)2個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的特異性引物，用于陳皮和果皮的多重等位基因特異PCR系統(tǒng)鑒定。SNP分析在藥用植物物種鑒定，道地性和遺傳多樣性研究等方面的應(yīng)用前景廣闊。

1.5簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)又稱微衛(wèi)星標(biāo)記，是指基因組中由1～6個(gè)核苷酸為基本單位，經(jīng)重復(fù)串聯(lián)多次構(gòu)成一段DNA重復(fù)序列。其優(yōu)點(diǎn)是數(shù)量多，重復(fù)性、信息量和多態(tài)性高。因而SSR通常應(yīng)用于分子指紋圖譜構(gòu)建、物種品種鑒定和分子輔助育種等。劉亞令等[13]對(duì)380個(gè)黃芪樣本進(jìn)行SSR遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)分析顯示，藥用黃芪具有較高程度的遺傳多樣性水平，且2種黃芪的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)部，為藥用黃芪種質(zhì)資源的有效利用、遺傳多樣性保護(hù)、育種及開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)黃芪種質(zhì)資源提供一定的理論基礎(chǔ)。LU等[14]利用EST-SSR和SRAP技術(shù)構(gòu)建鐵皮石斛和杜仲雜種圖譜，為遺傳學(xué)研究提供了基礎(chǔ)，并有助于石斛品種育種計(jì)劃中醫(yī)學(xué)性狀的定位和標(biāo)記輔助選擇研究。基于SSR分子標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜及遺傳多樣性研究，可為藥用植物種質(zhì)資源的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1.6葉綠體全序列分析

葉綠體基因組是葉綠體內(nèi)相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，由于其高度保守性、進(jìn)化速率較慢的特性，使其成為不同物種間的分類鑒定研究的重要工具，為后期藥用植物新條形碼的開(kāi)發(fā)提供了條件。近期有研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體在藥用植物方面的應(yīng)用有道地性遺傳研究、物種鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育等，也可用于篩選出高變區(qū)作為潛在的分子標(biāo)記。姜丹[15]研究表明，在不同地區(qū)黃芩中，黃芩道地產(chǎn)區(qū)的遺傳多樣性高于非道地產(chǎn)區(qū)，且道地產(chǎn)區(qū)是黃芩的遺傳多樣性中心，可對(duì)黃芩及其他道地藥材的可持續(xù)利用提供依據(jù)。張明英等[16]比對(duì)分析了10種柴胡屬葉綠體基因組結(jié)果表明，葉綠體全基因組可準(zhǔn)確鑒定柴胡屬植物。CHEN等[17]基于16種葉綠體基因組構(gòu)建的ML和MP進(jìn)化樹(shù)，可有效鑒別3種麻黃屬植物，表明葉綠體基因組具有成為物種鑒定超級(jí)條形碼的潛力；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，麻黃屬植物與買麻藤屬植物、百歲蘭具有更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。TAN等[18]從皂莢和山皂莢的130個(gè)基因中鑒定出SSC區(qū)域的ycf1b核苷酸變異性最高，明顯高于植物通用標(biāo)記區(qū)域rbcL、ndhF、rpl16、trnL-trnF、trnL intron、psbA-trnH和matK，揭示ycf1b作為DNA條形碼候選區(qū)域的潛能。利用葉綠體基因組以開(kāi)發(fā)新的DNA條形碼，可提高金錢(qián)草及其他藥用植物質(zhì)量鑒定的有效性和準(zhǔn)確性，可促進(jìn)其系統(tǒng)發(fā)育及道地性研究。

分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展和葉綠體全序列的深入研究，對(duì)于藥用植物資源的研究影響較大。除前述幾種常見(jiàn)標(biāo)記技術(shù)外，還有RAPD、ISSR、SRAP、CAPS和STS等分子標(biāo)記技術(shù)也在藥用植物各方面的研究中具有重要的技術(shù)支撐作用。分子標(biāo)記間各有優(yōu)勢(shì)與不足，與AFLP、RAPD等技術(shù)相比，SSR和ISSR具有多態(tài)性更高更豐富，表明單一的某種標(biāo)記技術(shù)在藥用植物研究領(lǐng)域的局限性。多種技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生的新的標(biāo)記技術(shù)使得藥用植物資源研究更加準(zhǔn)確和全面，分子鑒定在理論和方法上日趨成熟。

2金錢(qián)草的研究

正品金錢(qián)草藥材為報(bào)春花科珍珠菜屬植物過(guò)路黃(LysimachiachristinaeHance)的干燥全草，又名大金錢(qián)草、對(duì)座草、路邊黃和遍地黃等，味苦，酸，微寒。具有清熱解毒、利尿排石和活血散淤等功能。近年來(lái)，中藥材市場(chǎng)銷售及臨床應(yīng)用上經(jīng)常發(fā)現(xiàn)金錢(qián)草地方習(xí)用品和混用品被當(dāng)作金錢(qián)草正品藥材使用，造成金錢(qián)草質(zhì)量和安全性得不到保障，給臨床應(yīng)用造成安全隱患，降低其治療效果。

2.1地方習(xí)用品與市場(chǎng)混用品

全國(guó)各地金錢(qián)草地方習(xí)用品和市場(chǎng)混用品眾多，因此識(shí)別主要地方金錢(qián)草習(xí)用品和混用品，才能正確區(qū)分鑒別正品金錢(qián)草。在市場(chǎng)上除金錢(qián)草正品外，其地方習(xí)用品和混用品眾多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前至少有7科14種植物被作為金錢(qián)草在各地使用，常見(jiàn)的地方習(xí)用品和混用品包括點(diǎn)腺過(guò)路黃、天胡荽、活血丹、廣金錢(qián)草、馬蹄金和積雪草。近年研究發(fā)現(xiàn)，其同屬植物聚花過(guò)路黃和巴東過(guò)路黃等也作為金錢(qián)草偽品在市場(chǎng)上流通。

點(diǎn)腺過(guò)路黃為報(bào)春花科植物點(diǎn)腺過(guò)路黃的全草，因其性味歸經(jīng)和功能主治與正品金錢(qián)草相似，在浙江地區(qū)作金錢(qián)草使用。天胡荽及其變種白毛天胡荽，為傘形科植物天胡荽的全草，又稱破銅錢(qián)，在江西地區(qū)被當(dāng)作金錢(qián)草使用，功效更偏向治痢疾，利水作用強(qiáng)，可治目翳。活血丹為唇形科植物活血丹的干燥地上部分，又稱大葉金錢(qián)草和連錢(qián)草，在上海和江蘇地區(qū)作為金錢(qián)草地方習(xí)用品。這是因?yàn)槠渖撑c藥效與過(guò)路黃相似，也常生于路邊荒地濕氣大的地方，可利水通淋治結(jié)石。廣金錢(qián)草是豆科植物，其地上部分在湖南及兩廣地區(qū)作為金錢(qián)草混用品使用，其在治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石方面效果更佳。馬蹄金為旋花科植物馬蹄金的全草，又稱小金錢(qián)草，在永州地區(qū)作金錢(qián)草混用品使用，其功效與金錢(qián)草的最大差別是馬蹄金對(duì)結(jié)石無(wú)治療作用。積雪草為傘形科植物積雪草的全草，在湖南永順地區(qū)為金錢(qián)草混用品，與金錢(qián)草相比，積雪草在清熱解毒方面效果更好。聚花過(guò)路黃和巴東過(guò)路黃與金錢(qián)草來(lái)源于同科同屬，是金錢(qián)草的混偽品，因其形態(tài)相似，在四川地區(qū)易被當(dāng)作金錢(qián)草使用。金錢(qián)草習(xí)用品和混用品與金錢(qián)草正品存在較多方面的不同，兩者混淆使用會(huì)對(duì)金錢(qián)草的臨床應(yīng)用造成隱患。因此，迫切需要尋找快速鑒別不同地區(qū)金錢(qián)草習(xí)用品和混用品的方法。

2.2化學(xué)成分

金錢(qián)草的功效與其化學(xué)成分組成相關(guān)，金錢(qián)草的初步分析得出其含有酚類、黃酮類、甙類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、氨基酸、膽堿、甾醇、氯化鉀和內(nèi)脂類等成分，其中黃酮類化合物研究較為深入[19]。沈聯(lián)德等[20]從金錢(qián)草分離得到六個(gè)黃酮類化合物，此外，還分離出兩種無(wú)機(jī)鹽結(jié)晶，檢驗(yàn)出其中具有硝酸鹽的存在。趙世萍[21]等還分離出尿嘧啶和對(duì)羥基苯甲酸。侯冬巖[22]等用水蒸氣-萃取法提取金錢(qián)草揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)主要為樟腦、山奈酚和石竹烯醇等。

2.3藥理作用

金錢(qián)草的藥理作用廣泛，具有利尿通淋、除濕退黃等功效，其對(duì)治療肝膽結(jié)石效果顯著，是治結(jié)石之要藥。YANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，金錢(qián)草提取物體內(nèi)具有明顯的抗膽囊炎和利膽活性。金錢(qián)草還具有利尿[24]和鎮(zhèn)痛[25]作用。王萍等[26]采用體外模擬的技術(shù)，使用 SEM，F(xiàn)T-IR和 XRD等檢測(cè)方法對(duì)提取的晶體研究發(fā)現(xiàn)，金錢(qián)草具有排石作用。此外，金錢(qián)草還具有抗氧化和抗菌等藥理活性[27]。金錢(qián)草藥理作用的深入研究，不僅有利于金錢(qián)草的臨床治療應(yīng)用，還為金錢(qián)草藥品開(kāi)發(fā)方向和提高利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

2.4臨床應(yīng)用

金錢(qián)草在中醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛，常用于治療結(jié)石、黃疸型肝炎、慢性前列腺炎、尿潴留和慢性膽囊炎等[28]。據(jù)文獻(xiàn)記載，諸多排石中藥配方中金錢(qián)草均為君藥，是治療結(jié)石(膀胱結(jié)石、膽囊結(jié)石等)的有效中草藥。齊鵬[29]研究表明，以金錢(qián)草為主藥，對(duì)急性黃疸型肝炎、慢性前列腺炎、慢性膽囊炎和尿潴留4種病癥進(jìn)行治療，其治愈率高。金錢(qián)草臨床應(yīng)用范圍極廣，藥用價(jià)值極高，具有安全性高、價(jià)格實(shí)惠、資源豐富等特點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)金錢(qián)草臨床應(yīng)用的研究，充分發(fā)揮其醫(yī)療功效。

2.5產(chǎn)品開(kāi)發(fā)

金錢(qián)草藥品因其良好功效在市場(chǎng)上銷售應(yīng)用廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有99種中成藥中使用金錢(qián)草。此外，為提高金錢(qián)草的臨床治療效果，有以金錢(qián)草藥劑配伍其他中成藥的治療效果良好。其中，中成藥中藥金錢(qián)草沖劑具有清熱解毒和利尿排石作用，既可清熱利濕，又可解毒通淋，同時(shí)可減少晶體形成，對(duì)于膀胱濕熱、尿路感染、尿路結(jié)石和腎絞痛等有良好的輔助治療作用。復(fù)方金錢(qián)草顆粒具有清熱祛濕，利尿排石，消炎止痛，用于治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石和尿路感染等[30]。氧氟沙星與金錢(qián)草沖劑聯(lián)合治療尿路感染和復(fù)雜性尿路感染，可顯著提高治療的有效率[31]。清熱利膽片組方中的金錢(qián)草具有清熱利膽功效，適用于急性單純性膽囊炎、輕度化膿性膽囊炎、急性膽源性胰腺炎、膽管炎和膽道術(shù)后綜合征等[32]。金錢(qián)草開(kāi)發(fā)應(yīng)用較廣，其制成的中成藥較多，市場(chǎng)銷售量大，是良好的中成藥制備藥材，但由于其習(xí)用品和混用品的存在藥品質(zhì)量降低，應(yīng)探究其更好的鑒別技術(shù)，以提高金錢(qián)草藥品在臨床上的應(yīng)用效果。

3展望

分子標(biāo)記技術(shù)和葉綠體全序列在現(xiàn)代藥用植物種質(zhì)資源與道地性評(píng)價(jià)、親緣關(guān)系分析與正偽品鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，有利于促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但是，多數(shù)分子標(biāo)記方法耗時(shí)耗力，不利于推廣和實(shí)際應(yīng)用，且在DNA的研究中，使用的基因片段多為ITS、matK、rbcL和psbA-trnH等，對(duì)其新型片段的開(kāi)發(fā)應(yīng)用較少，仍無(wú)法對(duì)部分疑難物種進(jìn)行鑒別[33]。因此，后續(xù)研究應(yīng)建立省時(shí)省力、節(jié)約成本的分子標(biāo)記技術(shù)，同時(shí)更加注重特異性強(qiáng)的位點(diǎn)或片段，以開(kāi)發(fā)出新型片段。同時(shí)，金錢(qián)草藥用價(jià)值高，但其市售質(zhì)量參差不齊，且金錢(qián)草及其習(xí)用品和混偽品的臨床應(yīng)用存在差異，濫用可能會(huì)造成不良影響，其常見(jiàn)鑒別方式有性狀鑒別、顯微和薄層色譜，但易受技術(shù)及條件等的影響，鑒別效率不高。因此，亟待探尋高效準(zhǔn)確的方法對(duì)金錢(qián)草及其習(xí)用品和混用品的質(zhì)量進(jìn)行鑒別。以期分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合葉綠體全序列分析技術(shù)能夠探尋出金錢(qián)草的特征性DNA片段，利用其對(duì)金錢(qián)草及其混偽品進(jìn)行快速區(qū)分，提高鑒定準(zhǔn)確性，為臨床用藥和后續(xù)應(yīng)用提供指導(dǎo)。