新型冠狀病毒疫情下細(xì)胞學(xué)標(biāo)本固定后的蠟塊制作體會(huì)

劉 甜，任家材，張世英，任俊奇，袁靜萍

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)作為一種急性呼吸道傳染病，可通過飛沫、氣溶膠等方式進(jìn)行傳播[1]。病理科細(xì)胞室工作人員在日常工作中，會(huì)接觸確診或疑似COVID-19患者的痰液、胸腔積液、腹腔積液等標(biāo)本，這些標(biāo)本在離心包埋過程中易產(chǎn)生氣溶膠污染以及液體飛濺導(dǎo)致的體液污染，因此如何在細(xì)胞學(xué)制片的技術(shù)環(huán)節(jié)阻斷生物安全隱患對(duì)醫(yī)務(wù)人員的安全防護(hù)具有重要意義。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)屬于β屬的冠狀病毒，對(duì)紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、75%乙醇、含氯消毒劑等脂溶劑均可有效滅活病毒，病理科常用的福爾馬林、戊二醛也可以通過烷基化反應(yīng)有效滅活SARS-CoV-2[2]。然而，筆者發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定后的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本常常發(fā)生細(xì)胞固縮，尤其是細(xì)胞學(xué)涂片標(biāo)本細(xì)胞固縮較為嚴(yán)重，對(duì)診斷影響較大，但福爾馬林對(duì)免疫組化影響不大。如果將固定后的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本收集制作細(xì)胞蠟塊，結(jié)合免疫組化可達(dá)到明確診斷的同時(shí)預(yù)防SARS-CoV-2感染傳播效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020年3月武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科細(xì)胞室接收的胸、腹腔積液標(biāo)本3例作為研究對(duì)象，所有標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)均為陰性，但為防止可能的感染，病理細(xì)胞室在崗技術(shù)人員接收標(biāo)本時(shí)仍需重點(diǎn)做好三級(jí)防護(hù)措施，應(yīng)戴口罩、手套、護(hù)目鏡、穿防護(hù)服。

1.2 方法將接收后的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本一部分作為固定組，按照細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與100%福爾馬林原液10 ∶1的比例混勻后(福爾馬林濃度為10%)固定4～6 h后再離心。剩余細(xì)胞學(xué)標(biāo)本作為未固定組，采用傳統(tǒng)方法，即不加固定液直接離心。離心后的標(biāo)本按照常規(guī)操作制作細(xì)胞涂片和細(xì)胞蠟塊，分別采用瑞氏-吉姆薩染色和HE染色觀察細(xì)胞病理形態(tài)，若細(xì)胞蠟塊HE染色切片中查見腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步行免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法，抗體購(gòu)自DAKO公司。

2 結(jié)果

2.1 福爾馬林固定對(duì)細(xì)胞涂片瑞氏-吉姆薩染色的影響未固定組制作出的細(xì)胞涂片，脫落細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異型性明顯，細(xì)胞呈團(tuán)片狀分布，核質(zhì)比高，細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染，染色質(zhì)及核膜清晰，可以分辨細(xì)胞類型(圖1)；經(jīng)福爾馬林固定后，鏡下見細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞呈團(tuán)狀分布，細(xì)胞核皺縮明顯，結(jié)構(gòu)不清，未見明顯細(xì)胞質(zhì)(圖2)，對(duì)診斷影響很大。

2.2 福爾馬林固定對(duì)細(xì)胞蠟塊HE染色的影響固定組與未固定組中細(xì)胞蠟塊HE染色均可見大量散在分布的腫瘤細(xì)胞，部分呈巢狀分布，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)嗜酸性，細(xì)胞核呈毛玻璃狀(圖3、4)。相對(duì)于未固定組，固定組中福爾馬林對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)有一定的影響，可見細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核形態(tài)模糊，胞質(zhì)內(nèi)沉淀增加。此外，比較固定后的細(xì)胞涂片和細(xì)胞蠟塊中的細(xì)胞形態(tài)，可見福爾馬林固定對(duì)細(xì)胞蠟塊中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響低于細(xì)胞涂片。

2.3 福爾馬林固定對(duì)細(xì)胞蠟塊免疫組化染色的影響由于細(xì)胞涂片細(xì)胞量通常較少，而細(xì)胞蠟塊含有大量散在分布的腫瘤細(xì)胞，具有組織學(xué)形態(tài)，可通過免疫組化進(jìn)一步輔助判斷腫瘤細(xì)胞的來源及分類。筆者發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定對(duì)免疫組化影響較小：固定組與未固定組中免疫組化染色背景均干凈，細(xì)胞質(zhì)(圖5、6)、細(xì)胞膜(圖7、8)及細(xì)胞核(圖9、10)的陽性著色部位均正確，且特異性強(qiáng)，無非特異性著色。

3 討論

COVID-19作為一種急性呼吸道傳染病已被納入《傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并要求采取甲類傳染病的預(yù)防與控制措施[3]。病理細(xì)胞室會(huì)接觸感染性標(biāo)本，包括未滅活的含SARS-CoV-2的標(biāo)本，如痰、支氣管灌洗液、纖維支氣管鏡涂片和胸、腹水標(biāo)本等。因此，對(duì)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行固定滅活尤其重要，以防止生物安全感染。福爾馬林對(duì)各種病原體(細(xì)菌、芽胞、病毒等)有強(qiáng)大的滅活作用。據(jù)報(bào)道，0.05%～0.25%甲醛在6～12 h內(nèi)能殺死細(xì)菌、芽胞及病毒，1%～2%甲醛在幾分鐘內(nèi)可殺死普通細(xì)菌，4%甲醛15 min可殺死炭疽芽胞、結(jié)核桿菌及多數(shù)病毒。病理科常用福爾馬林原液(即40%甲醛)以體積比1 ∶10比例固定細(xì)胞學(xué)標(biāo)本以防止胸水變質(zhì)退變，同時(shí)也能達(dá)到對(duì)標(biāo)本固定滅活的作用[4-5]。

福爾馬林雖然具有滅活病毒和標(biāo)本固定的作用，然而經(jīng)福爾馬林固定后的細(xì)胞胞核染色加深，細(xì)胞形態(tài)易皺縮。筆者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本固定后制作的細(xì)胞涂片細(xì)胞量減少，細(xì)胞核皺縮明顯，結(jié)構(gòu)不清，未見明顯細(xì)胞質(zhì)，無法明確診斷，因此防疫期間盡量避免細(xì)胞涂片的特殊操作。雖然福爾馬林固定使細(xì)胞蠟塊中細(xì)胞形態(tài)皺縮，但相比于細(xì)胞涂片，福爾馬林固定對(duì)細(xì)胞蠟塊中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響較小，我們?nèi)匀荒軌驈墓潭ê蟮募?xì)胞蠟塊HE染色中觀察到大量散在分布的腫瘤細(xì)胞，究其原因可能是細(xì)胞涂片一般細(xì)胞量少，無組織結(jié)構(gòu)，經(jīng)福爾馬林固定后細(xì)胞縮小更易脫落，因此殘余的散在分布且皺縮明顯的細(xì)胞對(duì)診斷影響較大，而細(xì)胞蠟塊收集的細(xì)胞豐富且集中，有較好的組織結(jié)構(gòu)，類似于組織蠟塊，而福爾馬林對(duì)組織收縮較小，因此福爾馬林對(duì)細(xì)胞蠟塊中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)整體影響小于細(xì)胞涂片。另一方面，細(xì)胞蠟塊還可以通過免疫組化進(jìn)一步明確診斷腫瘤細(xì)胞類型及來源。福爾馬林固定液主要通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用，因此可原位保存抗原，且對(duì)組織穿透性強(qiáng)，收縮性小，是免疫組化應(yīng)用最廣泛的固定液[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，福爾馬林固定液對(duì)細(xì)胞蠟塊中細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核的陽性著色及定位影響均較小。因此，在COVID-19疫情期間，不建議做細(xì)胞學(xué)涂片，建議對(duì)新鮮的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本用福爾馬林固定后制作細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化結(jié)果來進(jìn)行診斷，從而在預(yù)防生物安全感染的基礎(chǔ)上保證醫(yī)療質(zhì)量。

工作人員雖然已經(jīng)采用對(duì)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行固定后再操作以減少細(xì)胞學(xué)生物安全感染，但仍需做好自身防護(hù)，這樣才能保證醫(yī)療生物安全。因此病理細(xì)胞室應(yīng)使用專門通道接收細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，且接收細(xì)胞學(xué)標(biāo)本過程中不應(yīng)打開密閉包裝，密閉包裝外表使用75%醫(yī)用乙醇(或1 000 mg/L的含氯消毒液)進(jìn)行噴灑消毒(注意保護(hù)樣本標(biāo)簽)。請(qǐng)注意乙醇和含氯消毒液會(huì)使某些標(biāo)記筆書寫消失。接觸感染性標(biāo)本的人員應(yīng)執(zhí)行三級(jí)防護(hù)，至少應(yīng)著醫(yī)用防護(hù)口罩、帽子、護(hù)目鏡(或防護(hù)面屏)、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套及鞋套，操作完畢后應(yīng)及時(shí)更換外層乳膠手套。完成工作后，應(yīng)該按照標(biāo)準(zhǔn)步驟脫掉防護(hù)用品，并做好手部衛(wèi)生。剩余的胸、腹腔積液以及痰液應(yīng)統(tǒng)一放置專門回收容器按照醫(yī)療廢棄物或者感染廢棄物進(jìn)行處理。每天檢測(cè)完畢后，工作環(huán)境使用紫外線照射消毒1 h，設(shè)備表面、臺(tái)面及地面按規(guī)定進(jìn)行清潔、消毒。

綜上所述，作者建議疫情期間病理細(xì)胞學(xué)標(biāo)本固定后制作細(xì)胞蠟塊進(jìn)行診斷，同時(shí)也要做好細(xì)胞病理室的生物安全防護(hù)。