長鏈非編碼RNA編碼肽在腫瘤中的作用機制

孟一妹，蔣 晶，王禹涵，孟一姊，閆 昱，李佩玲

長鏈非編碼RNA(lncRNA)長度一般超過200個核苷酸，既往學者認為其缺乏開放的讀碼框架，故不具備蛋白質編碼功能[1]。lncRNA在多個層面上參與基因的表達及調控，在多種腫瘤中呈異常表達并且與腫瘤發生和發展密切相關[2]。近年來有研究發現，lncRNA的短開放閱讀框(sORF)可以編碼功能肽，lncRNA可以有一個或多個sORF，能夠被翻譯成<100個氨基酸長的小肽，只是一般基因注釋流程都默認過濾掉100個氨基酸以下的肽，認為這些是假陽性的結果[3]，故一直以來都被忽略。隨著新一代測序技術及生物信息學技術的提高，人們才發現這些非編碼RNA分子其實也是普遍翻譯的，從而打開了lncRNA編碼肽的研究大門[4-5]。lncRNA編碼肽被證實在細胞分裂、鈣及線粒體代謝和毒素降解中發揮重要作用，并且在腫瘤發生和發展中有潛在應用前景[6-11]。本文就lncRNA編碼肽在腫瘤中的作用機制作一綜述如下。

1 lncRNA編碼肽與結腸癌

結腸癌是常見消化系統腫瘤之一。在美國，結腸癌是僅次于肺癌的第二大死因[12]。有學者利用實時熒光定量聚合酶鏈反應及微陣列數據集發現，與正常組織相比，HOXB-AS3 RNA在結腸癌組織中下調；通過核糖體分析顯示HOXB-AS3 RNA與核糖體結合具有翻譯可能性，lncRNA HOXB-AS3包含一個159 nt的sORF，該sORF可編碼一個53 aa肽；通過構建sORF的標簽載體，體內外等一系列實驗顯示，HOXB-AS3小肽而不是lncRNA發揮著功能，HOXB-AS3小肽能夠抑制結腸癌的進展；生物信息學分析發現與HOXB-AS3小肽相互作用的蛋白與RNA剪切相關；其進一步挑選了剪切抑制因子hnRNPA1作為研究對象，實驗得出在腫瘤細胞中，HOXB-AS3小肽的表達缺失使PKM基因的剪切形式為保留10號外顯子，而非9號外顯子，從而介導PKM2剪切體形成，抑制PKM1剪切體形成，最終導致腫瘤細胞有氧糖酵解，促使結腸癌發生和發展[13]。總之，HOXB-AS3多肽低表達與結腸癌預后差密切相關，可以作為結腸癌的預后標志物。

隨后上述團隊陸續發現2個可編碼肽的lncRNA。第1個是lncRNA LOC90024[14]。通過上述實驗方法證實lncRNA LOC90024可編碼一個130 aa的小肽；通過質譜檢測及對小肽的進一步功能分析證實，該小肽是人體細胞和組織中自然產生的內源性物質，且是小肽而不是lncRNA LOC90024本身促使了結腸癌的發生、發展和侵襲、轉移。隨后其通過蛋白質相互作用組學等證實此小肽主要與mRNA剪切調控分子相互作用，于是將此小肽命名為剪切分子調控小蛋白SRSP，SRSP與剪接因子SRSF3相互作用。他們進一步實驗證實SRSP增強了SRSF3與轉錄因子Sp4 pre-mRNA 外顯子3的結合，介導外顯子3的包含，從而促使長的Sp4剪切體(L-Sp4)產生，抑制短的Sp4剪切體(S-Sp4)產生。該團隊在Sp4-KD型結腸癌細胞中恢復了L-Sp4或S-Sp4的表達，發現L-Sp4刺激腫瘤的發生。綜上所述，lncRNA LOC90024編碼一個小蛋白SRSP，調控Sp4剪接和結腸癌的發生，SRSP可作為一種新的結腸癌預后生物標志物和治療靶點。

m6A是最普遍的真核RNA修飾。RNA m6A修飾的生物學重要性依賴于m6A結合蛋白(即m6A讀卡器)，通過調節mRNA的穩定性、翻譯、剪接、結構、衰老和亞細胞定位來控制mRNA的命運[15-18]。上述團隊發現的第2個可編碼肽的lncRNA是LINC00266-1[19]。LINC00266-1編碼一個71個氨基酸的多肽，通過質譜分析等發現此多肽主要與RNA結合蛋白結合，故將其命名為RNA結合調節多肽(RBRP)。RBRP為內源性產生的多肽，表達上調與結腸癌的惡性表型和臨床預后差密切相關。通過組學分析、免疫共沉淀及功能實驗等發現RBRP與RNA m6A讀碼器IGF2BP1相互作用。既往研究表明C-Myc是最重要的致癌基因之一[20]，RBRP作為m6A讀碼器的調節亞基，通過m6A讀碼器IGF2BP1增強m6A對C-Myc mRNA的識別，增加C-Myc mRNA的穩定性和表達，促進腫瘤發生。綜上所述，LINC00266-1實際上編碼了一種未標記的肽RBRP，該肽在腫瘤發生過程中具有促進作用，這一發現突出了靶向RBRP治療癌癥的潛力。

2 lncRNA編碼肽與乳腺癌

三陰性乳腺癌不表達3種最常見乳腺癌標志物，是最具侵襲性乳腺癌亞型，預后較差，總生存期較短[21]。有學者從TCGA數據庫中識別出三陰性乳腺癌特異性lncRNA，并使用GWIPS-viz數據集等發現具有編碼潛力的LINC00908；通過免疫熒光、Western blot和多聚體分析實驗等驗證了LINC00908可編碼一個60個氨基酸名為ASRPS的多肽，且在三陰性乳腺癌細胞株中ASRPS呈低表達;體外實驗證實LINC00908可通過ASRPS抑制三陰性乳腺癌腫瘤生長;Log-rank檢驗和Kaplan-meier生存曲線分析發現ASRPS低表達的三陰性乳腺癌患者總生存期短于ASRPS高表達的三陰性乳腺癌患者；熒光素酶報告基因、序列缺失和CHIP實驗等發現ERα直接調控LINC00908轉錄；進一步通過COIP、免疫組織化學及使用CRISPR/cas9介導的同源重組等技術研究得出ASRPS直接與STAT3結合，下調STAT3磷酸化，導致血管內皮生長因子表達降低；最后在小鼠模型中，再次證實ASRPS高表達減少血管生成，抑制腫瘤生長[22]。總之，LINC00908編碼的多肽ASRPS是三陰性乳腺癌特異性治療靶點。

隨后該團隊發現一個可編碼肽的lncRNA[23]。LINC00665可編碼一個55個氨基酸的內源性表達小肽，并命名為CIP2A-BP。通過檢測兩個獨立臨床中心的三陰性乳腺癌樣本后，發現由LINC00665編碼的小肽與三陰性乳腺癌的預后不良有關。體外敲除和過表達研究證實是CIP2A-BP抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲，而不是LINC00665。經免疫共沉淀和質譜鑒定等方法發現了該小肽可以與腫瘤致癌基因CIP2A結合，取代PP2A的B56γ亞基，從而釋放PP2A活性，進而可以抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路的激活，影響下游基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和Snail等基因的表達，以此參與了三陰性乳腺癌的轉移和侵襲。最后該團隊在小鼠模型中引入CIP2A-BP基因或直接注射CIP2A-BP發現可減少肺轉移并提高總體生存率。總之，該團隊發現在三陰性乳腺癌中，轉化生長因子β經下調CIP2A-BP的翻譯，通過CIP2A/PP2A和PI3K/AKT/NF-κB信號通路誘導腫瘤侵襲和轉移，CIP2A-BP可作為一種抗腫瘤肽在未來治療中發揮作用。

3 lncRNA編碼肽與肝癌

Pang等[24]利用抗核糖體蛋白S6(RPS6)抗體對4種癌細胞系進行RNA免疫沉淀并測序，并對最顯著富集的lncRNA進行開放閱讀框預測和編碼潛力評估，通過公共數據庫分析所選lncRNA在肝癌中的表達，發現LINC00998上調顯著，且其表達水平與肝癌患者的生存率顯著相關。隨后其利用Uniprot基于同源性預測LINC00998可能編碼一個含有59個氨基酸的肽，并命名為SMIM30。通過構建載體、質譜分析、Western blot實驗及熒光成像等實驗證實了SMIM30的內源性表達，并且是SMIM30，而不是LINC00998本身，通過調節細胞增殖和遷移來促進肝癌的發生。SRC/YES1是一種酪氨酸激酶，該團隊通過實驗證實SMIM30是SRC/YES1膜錨定和激活狀態的重要適配子。通過轉錄組測序手段等驗證SMIM30激活下游MAPK通路，利用生物信息學手段測SMIM30啟動子區域存在轉錄因子C-Myc的結合位點。進一步實驗證實了C-Myc轉錄調控肝細胞癌細胞中SMIM30的表達，SMIM30激活MAPK信號通路促進了肝細胞癌進展。總之，LINC00998編碼的SMIM30可能是肝癌新的預后指標，并可能為肝癌治療提供一個特異性靶點。

乙型肝炎病毒慢性感染與肝癌發生密切相關[25]。Jia等[26]采用抑制消減雜交法從肝母細胞瘤細胞系HepG2中篩選到一個新基因，即lncRNA HBVPTPAP，用于研究HBV DNA聚合酶的反調節。據其全長序列的結構特點，將其歸類為lncRNA。該團隊為了進一步識別lncRNA HBVPTPAP的編碼潛力，使用CNCI、CPAT、CPC2和PhyloCSF等在線工具分析其編碼潛力，構建了pcDNA-ORF和pcDNA-ORF-gfp，并將其轉染到HepG2細胞中，驗證編碼肽的存在。進一步對HBVPTPAP基因過表達或敲低研究發現當HBVPTPAP基因過表達時，凋亡相關蛋白Bax上調，Bcl-2下調，說明HBVPTPAP基因可顯著促進凋亡；當HBVPTPAP基因過表達時，細胞色素C表達增加，pSTAT3相對表達降低，Bax/Bcl-2值降低。上述結果表明，在線粒體參與下，HBVPTPAP可能通過抑制pSTAT3活性促進細胞凋亡。

4 lncRNA編碼肽與頭頸癌

大多數頭頸癌起源于口腔、咽、喉的黏膜上皮，統稱為頭頸鱗狀細胞癌。目前，臨床上頭頸鱗狀細胞癌的治療方法包括手術和放療、化療等[27]。Li等[28]利用生物信息學手段篩選出差異表達的lncRNA RP11-469H8.6，發現其存在一個潛在的sORF，可能編碼一個含有51種氨基酸的未報道微肽。通過免疫熒光、CRISPR/cas9介導的同源重組、質譜及Western blot技術證實該微肽為內源性表達，其在頭頸鱗狀細胞癌中過表達可抑制腫瘤進展。又進一步利用免疫沉淀鑒定了水通道蛋白2(AQP2)、整合素β4(ITGβ4)和Septin 2(SEPT2)可能與該微肽相關。后通過酵母雙雜交實驗和qPCR等發現該微肽與AQP2存在直接相互作用，且該微肽的抑制作用可能與AQP2調控ITGB4和SEPT2有關。有文獻報道ITGB4和SEPT2與細胞運動和肌動蛋白細胞骨架有關[29]，將上述微肽命名為MIAC。該研究通過激光共聚焦光譜學實驗發現過表達MIAC或分別敲除AQP2、ITGB4、SEPT2可導致絲狀肌動蛋白應力纖維顯著減少。此外，分別敲除AQP2、ITGB4和SEPT2對頭頸鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移有抑制作用。綜上所述，MIAC是一種與頭頸鱗狀細胞癌進展密切相關的新型肽。

5 lncRNA編碼肽與食管癌

食管鱗狀細胞癌男性發病率較高，男女發病率和病死率有2～3倍的差異，且吸煙和性激素與食管鱗狀細胞癌的預后相關[30]。近期一項研究發現，Y染色體上的一個腫瘤抑制基因與男性乳腺癌有關[31]。表明Y染色體編碼的遺傳物質可能與男性主導腫瘤有關。然而，目前還沒有關于Y染色體相關的lncRNA參與食管鱗狀細胞癌的研究報道。Wu等[32]通過查找數據庫和qRT-PCR等尋找與Y染色體相關的在食管鱗狀細胞癌中差異表達的lncRNA，利用Log-rank檢驗和Kaplan-meier生存曲線分析,得出只有LINC00278在食管鱗狀細胞癌組織中顯著下調，LINC00278低表達的食管鱗狀細胞癌患者生存期明顯短于LINC00278高表達的食管鱗狀細胞癌患者。通過多變量分析，證實了吸煙及LINC00278低表達與食管鱗狀細胞癌患者生存期較短有關。通過免疫熒光和Western blot等多種實驗證明LINC00278可編碼一個在男性食管鱗狀細胞癌中內源性表達和下調的小肽。通過對該小肽進行功能實驗等發現，該小肽抑制了轉錄因子YY1與雄激素受體的相互作用，故將其命名為YY1BM。隨后該團隊通過實驗證實YY1BM通過AR信號通路降低了eEF2K的表達，并且YY1BM下調顯著上調了eEF2K的表達，抑制了細胞凋亡，從而使食管鱗狀細胞癌細胞更適應營養剝奪，并且吸煙減少了LINC00278的m6A修飾和YY1BM翻譯。綜上所述，LINC00278和YY1BM可以作為男性食管鱗狀細胞癌潛在的預后生物標志物和治療靶點。

總之，現lncRNA編碼肽在腫瘤中的研究處于探索階段，其在不同腫瘤中的具體作用機制有待更進一步研究。相信在不遠的將來，lncRNA編碼的功能肽可在癌癥診療和預后研究方面發揮重要作用。