應用液相色譜-串聯質譜測定慈竹筍殼提取物成分及其抑菌活性1)

唐昊 馬洪霜 王昌吉 王明珺 甘曉鳳 孫燦 羅朝兵

(樂山師范學院，樂山，614000)

慈竹(Bambusaemeiensis)屬于禾本科慈竹屬，廣泛分布于四川、貴州、湖南等低丘、平原地區，是我國西南地區具有較高經濟價值的竹種[1]。慈竹筍為慈竹的嫩芽部分，有著極高的食用、藥理價值，是夏季最受歡迎的時令筍之一。其鮮筍顏色潔白，口感清脆，可當作鮮菜或制成筍干、罐頭等多種食品[2]。然而，竹筍被加工成各種食用產品時會產生大量的竹筍廢棄物，對其處理不當將會造成較為嚴重的環境污染，給生活帶來不利影響。目前，我國雖然有著豐富的竹筍資源，但其總體利用率較低[3]。因此，如何高效地開發、利用竹筍廢棄物是當今竹產業中研究熱點之一[4]。

竹筍筍殼緊密地包裹著竹筍，隨著竹筍發育逐層掉落(圖1)。筍殼作為竹筍產業主要廢棄物之一，其應用主要是將筍殼制成紡織纖維、動物飼料、液體燃料及工業原料，對其的研究主要是針對筍殼內的活性酶[5]。楊樂等[6]利用樹脂法提取純化竹筍殼中的黃酮物質。謝濤等[7]研究了竹筍殼中木質素、纖維素、半纖維素的組合分離技術。Katsuzaki et al.[8]從竹筍殼中分離并鑒定出紫杉葉素(Taxifolin)、苜蓿素(Tricin)2種抗氧化物質。現有研究發現，筍殼提取物具有抑菌活性。Park et al.[9]采用不同溶劑提取了毛竹、紫竹竹筍中的活性物質，并測定了其抑菌作用、抗氧化能力及對血管緊張素轉化酶的抑制效果。高雪娟等[3]通過超聲波輔助-有機溶劑提取法獲取毛竹筍殼的活性物質，并探究其抑菌效果。Tanaka et al.[10]確定了竹筍皮中的甲醇提取物具有抑菌活性，分離出的活性成分鑒定為豆甾醇(Stigmasterol)、二氫菜子甾醇(Dihydrobrassicasterol)。許麗旋等[11]利用相似相溶原理提取毛竹筍殼中黃酮物質并對其進行了抑菌活性測定。

為了更好的挖掘筍殼的價值，實現竹產業效益的最大化，以現有研究為基礎，本研究以慈竹筍殼作為試驗原料，利用索氏提取法提取慈竹筍殼的活性物質，并通過液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定其組分。通過K-B抑菌圈方法測定慈竹筍殼提取物的抑菌活性，同時探究其穩定性是否受溫度、作用時間的影響。本研究為竹筍殼的高效利用及今后新型生物殺菌劑的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及供試菌種

2019年6月于四川省樂山市中區竹林(103°77′E，29°57′N)采集慈竹筍殼。置于陰涼環境通風，烘箱60 ℃烘干至恒質量，研磨成粉，過40目篩[3]后封存待用。

供試菌種為大腸桿菌(Escherichiacoli)、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、海綿膠煤炱菌(Scoriasspongiosa)，以上菌種均由竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室提供。

1.2 慈竹筍殼提取物的制備

參照洪宏等[12]的方法制備慈竹筍殼提取物。將抽提預處理1 d的定性濾紙及棉線取出，稱取5～10 g的慈竹筍殼粉末放入半徑為2.5 cm，高為10 cm左右的圓柱形濾紙包(最上端不超過虹吸管上端)，放入提取瓶內。添加120 mL的100%乙醇(2次虹吸的量)進行抽提，直至提取瓶中液體為無色或透明時停止抽提。用旋轉蒸發儀將收集瓶中綠色液體進行蒸發濃縮后得到1種膏狀物，裝存于瓶中，置冰箱4 ℃備用。

1.3 菌種活化及菌懸液制備

本試驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、Luria-Bertani培養基(LB)分別作為真菌、細菌的培養基，相關配制比例參照沈萍等[13]的方法。于冰箱4 ℃拿出供試菌種后，放入無菌操作臺中解凍。待菌種恢復到室溫狀態，劃線接種到相應培養基。細菌于37 ℃培養1 d，真菌于28 ℃培養2 d。挑選單菌落并轉接種到新鮮的培養基中培養，轉接2～3代，以充分活化菌株[14]。試驗前將菌種充分活化后，取6支無菌試管，4支試管中倒入LB培養基、2支試管中倒入PDA培養基(不超過試管的1/5)，制成斜面培養基。將4種細菌、2種真菌菌種分別通過接種環接種于LB、PDA斜面培養基，按上述條件進行培養。待培養完成，于無菌環境用接種環刮取供試菌種至無菌的2 mL離心管內，加入無菌蒸餾水，選擇血細胞計數板法，得到濃度為5×106～5×107個/mL的菌懸液[14]，放置備用。

1.4 抑菌活性試驗

待培養基稍涼(未凝固)后進行倒平板操作，每個平板約20 mL。放置一旁等待20～30 min。使用200 μL移液槍吸出0.2 mL菌懸液，移至相應培養皿中，迅速進行涂布操作，得到指示含菌平板[3]。各個菌株設置5次重復試驗，選擇未接種菌懸液的平板作為空白對照。

加無菌蒸餾水將慈竹筍殼提取物配成120 g·L-1的溶液用于試驗，采用K-B抑菌圈法研究抗菌活性。將濾紙借助打孔器制成6 mm小圓片，滅菌干燥，浸泡在足量(淹沒所有濾紙片)樣品溶液中處理1 h后取出，分別輕放于含菌平板中[15]，每個平板內呈三角形放置3片，選擇無菌水處理濾紙片用于空白對照。真菌濾紙片28 ℃培養2 d，細菌濾紙片37 ℃培養1 d后，觀察抑菌圈，并測量抑菌圈(含濾紙片)直徑，以抑菌圈直徑為指標評價慈竹筍殼提取物抑菌活性大小[3]。每項抑菌試驗設置平行重復5次。

1.5 最小抑菌質量濃度(MIC)測定

測定最小抑菌質量濃度參考高雪娟等[3]的方法。采用二倍稀釋法，將慈竹筍殼提取物用無菌蒸餾水對倍稀釋為質量濃度為140.000、70.000、35.000、17.500、8.750、4.375 g·L-1的溶液，其余步驟均同于抑菌活性試驗，每個質量濃度處理均設3次平行重復。將最小抑菌質量濃度(MIC)定為無抑菌圈出現時的質量濃度。

1.6 溫度影響試驗

用無菌蒸餾水配制120 g·L-1慈竹筍殼提取液備用。取2 mL溶液放入不同的滅菌試管內，經-20、50、100 ℃不同溫度條件處理30 min。選取大腸桿菌(革蘭氏陰性代表菌)、金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性代表菌)作為指示菌，重復抑菌活性試驗，比較高溫或低溫是否會對慈竹筍殼提取物抑菌活性產生影響。每個處理重復3次。

1.7 浸泡時間影響試驗

用無菌蒸餾水配制120 g·L-1慈竹筍殼提取液備用。選擇金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為試驗菌，將滅菌的6 mm圓形濾紙片浸透于一定量的樣品溶液中分別處理0.5、3.0、5.0 h后，重復抑菌試驗，比較不同處理時間對慈竹筍殼提取物抑菌作用是否產生影響。每個處理重復3次。

1.8 慈竹筍殼提取物成分測定

在樣本中加入1 mL 2-氯苯丙氨酸及溫度為-20 ℃甲醇，渦旋振蕩1 min。渦旋振蕩后，離心5 min(轉速為12 000 rpm·min-1，溫度為25 ℃)，傾出上清液后稀釋10倍，過0.22 μm濾膜，進行液相色譜-質譜(LC-MS)檢測。然后各取20 μL待測樣本混合成校正樣本，用來校正混合樣品分析結果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤。最后用剩余待測樣本進行LC-MS/MS檢測。

色譜條件：儀器采用Thermo Ultimate 3000，選用T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，將自動進樣器溫度調整為8 ℃，柱溫為40 ℃，以0.25 mL·min-1的速度進樣2 μL，其中選擇正離子：0.1%甲酸水(D)、0.1%甲酸乙腈(C)及負離子：5 mmol·L-1甲酸銨水(B)、乙腈(A)作為流動相進行梯度洗脫，具體程序為0～1 min，V(A)∶V(C)=2%；1～9 min，V(A)∶V(C)=2%～50%；9～12 min，V(A)∶V(C)=50%～98%；12～13.5 min，V(A)∶V(C)=98%；13.5～14 min，V(A)∶V(C)=98%～2%；14～20 min，正模式V(C)=2%(14～17 min，負模式V(A)=2%)。

質譜條件：儀器為Thermo Q Exactive Focus，質譜電離方式為電噴霧電離(ESI)，其中正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV。鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb，毛細管溫度為325 ℃，使用70 000的分辨率進行全掃描，范圍為81～1 000 m·z-1，高能誘導裂解(HCD)二級裂解，碰撞電壓為30 eV，選用動態排除將無關的質譜/質譜(MS/MS)信息去除。

1.9 數據處理

LC-MS所獲得的原始數據通過Proteowizard軟件(v3.0.8789)轉換成mzXML格式，再利用R語言(v3.1.3)的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊的操作，最終得到含有峰面積、質核比、保留時間等信息的數據矩陣。試驗所有數據的整理、分析均使用Excel 2010及SPSS軟件。

2 結果與分析

2.1 慈竹筍殼提取物成分組成

慈竹筍殼提取物共檢測鑒定出388種代謝物，按其初級代謝途徑共分為8類(表1)。其中與氨基酸代謝相關的代謝物種類最多，有126種，占總鑒定代謝物種類的32.47%，其質量占比為代謝物總質量的16.65%；鑒定到脂質代謝有104種，其質量占比在8大類代謝物中最高，占代謝物總質量的40.69%。

表1 慈竹筍殼提取物參與代謝途徑

按照代謝物特性，將這些代謝物分為49類(見表2)，其中有8類至少包含10種代謝物，分別是脂肪酰基類(56種)、羧酸及其衍生物類(47種)、有機氧化合物類(26種)、苯及取代并苯衍生物類(23種)、酚類化合物類(16種)、有機氮化合物類(11種)、黃酮類化合物類(10種)、孕烯醇酮脂類(10種)。

表2 慈竹筍殼提取物分類

續(表2)

我們對鑒定到的慈竹筍殼提取代謝物進行了進一步的分析，其中有20種代謝物的質量占總質量的比例超過了1%(表3)，包括脂肪酰基類1種(9,10-環氧十八烯酸，13.73%)；5’-脫氧核糖核苷類1種(5-硫代甲基酰苷，1.65%)；苯及取代并苯衍生物類2種(間羥基苯甲酸，5.89%、原兒茶酸，1.35%)；酚類化合物類3種(高香草酸，1.88%、對苯二酚，1.47%、3-甲氧酪胺，1.08%)；嘌呤核苷類1種(肌苷，1.01%)；羧酸及其衍生物4種(4-羥基肉桂酸，7.20%、γ-氨基丁酸，3.11%、間香豆酸，1.89%、4-羥基肉桂酰亞胺，1.35%)；有機氮化合物2種(植物鞘氨醇，4.33%、乙酰膽堿，2.11%)；脂肪酰基類2種(13-L-過氧化氫亞油酸，7.06%、9-羰基-反,順-共軛亞油酸，1.01%)；異喹啉及其衍生物1種(N-甲基烏藥堿，5.94%)；3種未知類(赤蘚糖醇，7.18%、12-氧植物二烯酸，1.23%、9(S)-羥基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸，1.04%)。

表3 慈竹筍殼提取物代謝物成分列表

2.2 慈竹筍殼提取物的抑菌活性

以無水乙醇為提取溶劑，將索式抽提法抽提得到的慈竹筍殼提取物用于真菌、細菌的抑菌試驗。測量對照組及試驗組抑菌圈大小，用來判斷慈竹筍殼提取物是否具有抑菌活性。如表4所示，桔青霉菌、海綿膠煤炱菌抑菌圈的大小在對照組與試驗組中均無差異，表明慈竹筍殼提取物對這2種真菌不具備抑制效果。對于供試的大腸桿菌等4種細菌，對照組與試驗組抑菌圈的大小存在顯著差異，表明慈竹筍殼提取物能抑制這4種細菌生長。同時，本試驗通過對比這4種細菌的抑菌圈大小發現，慈竹筍殼提取物對革蘭氏陰性菌的抑制效果強于革蘭氏陽性菌，如慈竹筍殼提取物對大腸桿菌的抑制效果最好，但慈竹筍殼提取物對大腸桿菌的抑菌效果與對肺炎克雷伯菌相比，無顯著優勢；但與糞腸球菌、金黃色葡萄球菌相比，有顯著差異(P>0.05)。分析可得，慈竹筍殼提取物對真菌無抑制作用，而對細菌具有抑制效果，尤其是革蘭氏陰性菌。

表4 慈竹筍殼提取物的抑菌圈直徑

2.3 最小抑菌質量濃度測定

為了定量研究慈竹筍殼提取物對常見細菌的抑制活性，本試驗測定了慈竹筍殼提取物的抑菌質量濃度，結果見表5。慈竹筍殼提取物可有效抑制大腸桿菌、肺炎克雷伯菌，且抑菌活性隨提取液質量濃度的增加而提高，其最小抑菌質量濃度均為4.375 g·L-1；慈竹筍殼提取物對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌的抑制效果相對較弱，其最小抑菌質量濃度均為8.750 g·L-1。

表5 慈竹筍殼提取物對供試菌種的最小抑菌質量濃度

2.4 溫度對抑菌活性的影響

高溫或低溫對慈竹筍殼提取物抑菌活性產生的影響見表6。慈竹筍殼提取物經-20 ℃低溫處理后，對4種細菌的抑菌活性有顯著性差異(P<0.05)；50 ℃高溫處理后，對4種細菌的抑菌活性顯著上升(P<0.05)；100 ℃高溫處理后，對4種細菌的抑菌活性顯著下降。溫度能夠影響慈竹筍殼提取物的抑菌效果，低溫處理會導致其對4種細菌的抑菌活性下降，而隨著溫度升高，抑制活性則上升，持續升高溫度后，抑制活性再次降低，但仍有抑菌活性。

表6 溫度對慈竹筍殼提取物抑菌作用的影響

2.5 浸泡時間對抑菌活性的影響

浸泡時間對慈竹筍殼提取物抑菌活性產生的影響見表7。隨著浸泡時間的增加，慈竹筍殼提取物對大腸桿菌的抑菌效果顯著上升(P<0.05)，浸泡5 h后，其抑菌圈直徑達到(17.02±0.30)mm。浸泡時間對肺炎克雷伯菌抑菌效果影響較大，但當浸泡時間從3 h增加到5 h，抑菌效果無顯著變化(P>0.05)。浸泡時間對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌抑菌效果影響較小，浸泡時間從3 h增加到5 h，抑菌效果無顯著變化(P>0.05)。由此說明，增加浸泡時間可增強慈竹筍殼提取物的抑菌效果。

表7 浸泡時間對慈竹筍殼提取物抑菌作用的影響

3 結論與討論

筍殼作為一種竹產業廢棄物，其提取物被證明具有抑菌效果[3,11]。本研究探究了慈竹筍殼乙醇提取物對4種細菌，包括2種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌)、2種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、糞腸球菌)，以及2種真菌(桔青霉菌、海綿膠煤炱菌)的抑菌效果。結果表明，慈竹筍殼提取物對真菌無抑制作用，對細菌具有抑制效果，與高雪娟等[3]研究結果一致。

已有研究表明，毛竹筍殼提取物在經過80、100、121 ℃處理后，仍有著很好的抑菌活性，且具有較好的熱穩定性[3]。本研究中，慈竹筍殼提取物經過-20 ℃、50 ℃、100 ℃處理后，抑菌活性發生顯著變化，但均具有較強活性，表明慈竹筍殼提取物同樣具有較好的熱穩定性。由于本試驗設置的溫度跨度較大，僅得出低溫或高溫對慈竹筍殼提取液的抑菌效果不會產生顯著影響。試驗數據顯示，慈竹筍殼提取物抑菌活性在50～100 ℃間出現了降低趨勢，推測在50～100 ℃存在1個抑菌活性拐點。毛竹筍殼提取物對部分細菌的最小抑菌質量濃度為8.750、4.375、35.000 g·L-1[3]，而本研究中，慈竹筍殼提取物對細菌的最小抑菌質量濃度為8.75 g·L-1或4.375 g·L-1，表明慈竹筍殼提取物與毛竹筍殼提取物在抑菌功能方面相似。

本研究運用LC-MS/MS分析了慈竹筍殼提取物成分組成。結果表明，慈竹筍殼提取物中含有大量酚酸類化合物，如苯酚、對苯二酚等，其化學結構中具有1個苯核，是對羥基苯甲酸、羥基苯丙烯酸的衍生物[15]。且有研究證明，酚酸類化合物可以抑制微生物生長、清除自由基等多種生物活性[14]。慈竹筍殼提取物中質量占比最高的是9,10-環氧十八烯酸，有研究表明，9,10-環氧十八烯酸具有較好的抑菌活性[16]。慈竹筍殼提取物中含有豐富的黃酮類化合物，研究表明，黃酮類化合物對細菌中的革蘭氏陰性菌、陽性菌均具有較好的抑菌效果[17-18]。慈竹筍殼提取物中含有8種甾體及其衍生物，而植物甾體化合物，如硫脲類化合物是具有抗菌生物活性的天然產物[19]。慈竹筍殼提取物具有豐富的抑菌活性物質，可進一步通過分離提純的方法深入研究這些活性物質的功能、機制。

本研究通過探究慈竹筍殼提取物的抑菌種類、最小抑菌質量濃度、溫度及浸泡時間對抑菌活性的影響，探究了其抑菌潛能，同時通過LC-MS/MS技術分析其活性成分，為慈竹筍殼的綜合利用及新型殺菌劑的開發提供了參考。