膀胱癌患者外周血CTC細胞中survivin的表達及意義

毛天賜，張偉，羅娟

1.空軍軍醫大學唐都醫院泌尿外科，陜西 西安 710038；2.西安市兒童醫院耳鼻喉科，陜西 西安 710038

膀胱癌主要是指發生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，在泌尿系統惡性腫瘤中十分常見。此病的發生與患者吸煙、職業接觸等因素相關，臨床上患者多出現血尿、尿頻、尿急、尿流梗阻等癥狀，對其正常生活帶來極大困擾，癥狀嚴重者危及生命[1-3]。膀胱癌患者較多數以浸潤的方式生長，首次治療后，具有較高的復發率，且患者遠期生存率較低，血行轉移主要以外周血中存在循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)為基礎，是膀胱癌遠處轉移的主要途徑[4-5]。而生存蛋白(survivin)是一種凋亡抑制基因，與腫瘤的進展、轉移之間具有一定相關性[6]。本研究對膀胱癌患者外周血CTC進行檢測，觀察其survivin的表達情況，分析其與患者腫瘤直徑、腫瘤分期等的相關性，進一步探究是否將其作為膀胱癌病情發展情況的監測指標，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇空軍軍醫大學唐都醫院于2019年1月至2020年11月期間收治的54膀胱癌患者為研究對象。其中男性40例，女性14例；年齡35～80歲，平均(57.50±3.22)歲。納入標準：①經手術病理證實，確診為膀胱癌；②未合并其他惡性腫瘤者；③同意納入本研究。排除標準：①合并嚴重心腦血管疾病，肝腎功能不全者；②近期接受抗腫瘤治療者；③具有精神類障礙，無法進行正常溝通交流者；④因其他原因中途放棄治療者；⑤臨床資料不全者。本研究經醫院倫理委員會批準后實施。

1.2 觀察指標與評價(檢測)方法 比較不同腫瘤直徑(<3 cm、≥3 cm)、病理分級(低級別、高級別)、腫瘤分期(T分期即

1.2.1 CTC檢測 首先應用紅細胞裂解液對采集的外周血樣本進行處理，去除紅細胞，之后以免疫磁珠分離法去除CD45+的白細胞。采取膜濾過法自白細胞中分離出CTC。最后，使用EDTA抗凝真空采血管再次采集膀胱癌患者10 mL的外周靜脈血，將最初收集的2 mL去除掉，以輕柔的力度將其進行上下顛倒，使其處于混勻狀態。將新鮮的血樣樣本放置于溫度為0℃～4℃的環境中進行保存，在運輸過程中，注意避免造成震蕩、碰撞。將紅細胞裂解液加入血樣中，同樣以輕柔的力度將其進行上下顛倒，使其處于混勻的狀態；將其放置于室溫環境中，持續5～8 min，至出現透明紅的情況。之后進行4℃的離心，300×g，持續10 min，離心處理后，可見管底處有淡紅色的細胞，呈團塊狀，將上清棄掉，之后加入4 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將細胞重懸，并保持輕柔的動作，對其細胞團塊進行上下捶打，使其呈分散狀。重懸細胞后，將200μL抗CD45的免疫磁珠加入，并放置于溫度為2℃～8℃的環境中進行孵化，持續30 min，在此期間，以輕柔的動作將其傾斜、旋轉。選取上清液，使用PBS進行重懸，將抗CD45、抗CK8、染核試劑依次加入，并將其混勻，放置于室溫內，持續30 min的孵化，CK8+CD45-DAPI+細胞便可被定義為CTC，使用24孔的5μm濾膜進行過濾，應用顯微鏡對不同型別的CTC進行觀察。

1.2.2 survivin蛋白表達檢測 于含有10%的胎牛血清RPMI-1640培養基、溫度為37℃、5%CO2條件下，對CTC細胞進行培養。培養之后，應用丙酮進行相應固定，持續10 min，之后放置于溫度為37℃、0.75%H2O2-PBS的環境中，持續浸泡30 min，再應用PBS進行振洗，之后將封閉血清加入，37℃持續30 min，將血清棄之，將比例為1∶100的survivin一抗加入，37℃持續30～60 min，再次使用PBS振洗，之后加入二抗，37℃30 min，PBS進行振洗，Tris-HCl緩沖液進行振洗，將新鮮的底物溶液浸入，之后進行水洗，將蘇木素染液浸入，再用水進行清洗，快速過鹽酸酒精，隨后用水洗，再過氨水，之后水洗，脫水過二甲苯，進行封片，使用顯微鏡進行相應觀察。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，計數資料比較采用χ2檢驗，均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC及survivin檢測結果 54例膀胱癌患者中25例檢出CTC，陽性率為46.30%(25/54)，主要包括13例上皮型CTC、7例間質型CTC、5例為混合型。上皮型CTC中7例為survivin陽性表達、占比53.85%；間質型CTC中均為survivin陽性表達、占比100.00%；混合型CTC中4例survivin陽性表達、占比80.00%。間質型CTC中survivin陽性率明顯高于上皮型和混合型CTC，差異有統計學意義(χ2=5.765、4.605，P<0.05)。

2.2 膀胱癌病理特征與CTC陽性率的關系 腫瘤直徑<3 cm、T分期0.05)，見表1。

表1 膀胱癌病理特征與CTC陽性率的關系[例(%)]

2.3 膀胱癌病理特征與survivin陽性率的關系 腫瘤病理分級中的高級別、T分期≥T2的survivin檢測陽性率明顯高于低級別及T分期0.05)，見表2。

表2 膀胱癌病理特征與survivin陽性率的關系[例(%)]

3 討論

膀胱癌是臨床上常見的泌尿系統腫瘤，具有較高的復發率，而腫瘤的復發、轉移與其預后之間具有密切的關系[7-9]。因此，及時對此病進行正確診斷及治療具有重要的臨床意義。研究指出通過分析膀胱癌患者外周血CTC細胞中survivin的表達情況，有助于了解其表達陽性率與患者病理分級、分期、病灶大小之間的關系，從而判定患者病情發展情況[10-11]。另有研究顯示，大約有半數的肌層浸潤性膀胱癌患者在初期治療時，可能會出現微轉移的情況[12-13]。

CTC主要是由腫瘤原發灶腫瘤細胞脫落、診療操作時，釋放入血液，隨之會形成相應的腫瘤微轉移灶，CTC主要是腫瘤發生相關血行轉移的基礎，在腫瘤轉移中，是其必需的前提之一[14]。對患者外周血進行檢測，若發現CTC，則可能會發生遠處轉移的風險，預后情況不佳。CTC主要可分為上皮型CTC、間質型CTC、混合型CTC，其中間質型CTC遷移、傳播能力較強，具有更強的侵襲能力，通過觀察其數量、表型的轉變，可在一定程度上提示患者疾病進展、治療的應答情況[15]。survivin屬于一種細胞凋亡抑制蛋白，主要位于第17號的染色體長臂上，包括4個外顯子、3個內含子，此物質對于細胞的凋亡具有一定抑制作用。survivin對細胞分裂具有調節作用，還可有效的參與至腫瘤血管生成過程，在膀胱癌組織中呈現為高表達[16]。有研究指出，若患者存在CTC，其數量越多則患者疾病的浸潤性會越強，復發時間也就相應越短，從而會顯著提高轉移的概率，增加患者疾病風險[17]。本研究發現，54例膀胱癌患者中有25例檢出CTC，陽性率為46.30%(25/54)；腫瘤直徑<3 cm、T分期

本研究主要根據CanPatrol技術、免疫磁珠法、膜濾過法等技術對膀胱癌患者外周血中的CTC進行檢測，與傳統檢測方法比較更加多樣化，且優勢更加明顯，可以將白細胞進行更有效的去除，且去除率較高；此外，本研究所應用的檢測方法可以對各種表型的CTC進行有效的收集，所收集的CTC細胞可在細胞培養、免疫熒光劑基因檢測等檢測中進行良好的運用，回收率更高[18]。54例膀胱癌患者檢測結果顯示，上皮型CTC中7例為陽性表達，占比53.85%；間質型CTC中均為陽性表達，占比100.00%；混合型CTC中4例陽性表達，占比80.00%。間質型陽性率顯著高于上皮型和混合型CTC。這可能是由于，間質型CTC的侵襲性較高，可能與survivin的高表達具有相關性，survivin通過對細胞的凋亡進行有效的抑制，對于細胞的分裂、腫瘤血管生成具有促進作用，從而侵襲性顯著增強。

綜上所述，膀胱癌患者CTC細胞陽性率、CTC細胞中survivin陽性表達與其病理分級、分期、直徑等之間具有一定相關性，可作為臨床評估病情的有效依據。