冬凌草中1個新的對映-貝殼杉烷二萜

劉 旭，陳春霞，吳繼洲

?化學成分 ?

冬凌草中1個新的對映-貝殼杉烷二萜

劉 旭1, 3，陳春霞2, 3*，吳繼洲3

1. 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 藥學部，湖北 武漢 430040 2. 武漢軟件工程職業學院，湖北 武漢 430070 3. 華中科技大學同濟醫學院藥學院，湖北 武漢 430040

研究鄂西地區產冬凌草的化學成分。采用多種柱色譜法進行分離純化，并經波譜分析鑒定化合物的結構。從湖北建始縣產冬凌草的乙醇浸提物中，分離鑒定出6個對映-貝殼杉烷二萜，分別為3β,6β,14β,15β-四乙酰氧基-20-醛-對映-貝殼杉-16-烯-7-酮（1）、川藏香茶菜素O（2）、enmenin（3）、enmenin monoacetate（4）、乙酰化毛萼晶F（5）、蕘花香茶菜乙素（6）。化合物1為1個新化合物，命名為建始冬凌草素J，為香茶菜屬植物極為少見的一類型對映-貝殼杉二萜，結構特點為C-20氧化為醛基而未與C-3、C-7、C-11形成常見的環氧橋結構。化合物2和4為首次從該植物中分離得到。

冬凌草；對映-貝殼杉烷；二萜；建始冬凌草素J；川藏香茶菜素O；蕘花香茶菜乙素

冬凌草(Hemsley) H. Hara系唇形科（Labiatae）香茶菜屬多年生草本植物，在河南民間用于治療咽炎、支氣管炎等炎癥和蟲蛇咬傷。1972年被以民間抗癌草藥發掘出來，后續研究證實了冬凌草在體外對癌細胞的細胞毒作用，對多種動物移植性腫瘤也有抗腫瘤作用[1]，尤其是特征性成分冬凌草甲素（oridonin）更是成為活性與機制研究的明星分子[2-3]。同時國內研究者相繼對產自河南、河北、貴州等多個不同縣市地區的冬凌草的化學成分研究取得了不同程度的進展，發現其富含結構新穎、多變的對映-貝殼杉類二萜化合物，且結構特點隨產地、生境不同有著明顯的區別[4-5]。

為全面了解湖北省內冬凌草資源利用的物質基礎，從地理生境獨特的湖北省恩施州建始縣采集了冬凌草樣品，以其95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位為研究對象，利用柱色譜分離技術及多種波譜手段進行了深入研究，得到6個對映-貝殼杉烷二萜，其中5個已知化合物經NMR數據對比鑒定為川藏香茶菜素O（pharicin O，2）、enmenin（3）、enmenin monoacetate（4）、乙酰化毛萼晶F（acetonide of maoyecrystal F，5）、蕘花香茶菜乙素（wikstroenioidin B，6）。1個新化合物利用2D NMR確定了平面和立體結構為3β,6β,14β,15β-四乙酰氧基-20-醛-對映-貝殼杉-16-烯-7-酮（1），命名為建始冬凌草素J（圖1）。化合物2和4為首次從該植物中分離得到。

圖1 化合物1～6的化學結構

1 儀器與材料

JASCO DIP-370型數字式旋光儀（日本分光株式會社）；Shimadzu UV-2401A型紫外光譜儀（日本島津制作所）；Tenor27型紅外光譜儀（德國布魯克光譜儀器公司）；ESIMS和HRESIMS用API-QSTAR飛行時間（美國應用系統公司）、Xevo TQ-S三重四級桿（英國沃特世公司）和Bruker HCT/Esquire離子阱質譜儀（德國布魯克道爾頓公司）；DRX-500型核磁共振儀（瑞士布魯克公司）。半制備型HPLC為Agilent1100 HPLC（DAD檢測器，美國安捷倫公司），色譜柱為Zorbax SB-C18（美國安捷倫公司，250 mm×9.4 mm，5 μm，3 mL/min）。反相色譜Lichroprep RP18（40～63 μm，美國Merck公司）。MCI（75～150 μm，日本Mitsubishi化學公司）。薄層硅膠板和柱色譜用正相硅膠（100～200目）均為青島海洋化工廠生產。色譜純甲醇（國藥集團化學試劑有限公司），其他試劑為分析純。

實驗藥材2019年采自湖北省恩施州建始縣，經武漢植物園王映明教授鑒定為唇形科為香茶菜屬植物冬凌草(Hemsley) H. Hara的干燥地上部分。

2 提取與分離

冬凌草地上部分（干質量10 kg）粉碎后用30 L 95%乙醇在室溫下浸泡4次，每次持續3 d。提取液幾乎蒸干后，用20 L醋酸乙酯和5 L水分散、萃取4次。得到醋酸乙酯部分（干質量約550 g）用600 g 100～200目硅膠拌樣，干法裝柱，以不同比例的氯仿-丙酮（1∶0～0∶1）進行梯度洗脫，用薄層色譜進行檢測，合并相同組分，除去純氯仿的部分（主要為油狀物）和純丙酮的部分（主要為黃酮類），得到剩余5個部分A～E。

B部分（120 g）用MCI樹脂脫色，以90%甲醇-水洗脫后，用正相硅膠色譜柱，石油醚-丙酮（20∶1～1∶1）梯度洗脫，得到B1～B5。B4（7.6 g）用反相RP-C18柱色譜，甲醇-水（40%～90%）梯度洗脫得到10個組分。B4/8（500 mg）通過半制備反相色譜得到化合物1（7 mg）和4（32 mg）。B4/6（630 mg）用同樣的半制備色譜得到化合物2（4.3 mg）。B4/4（920 mg）用正相硅膠色譜柱，以氯仿-丙酮（40∶1～30∶1）梯度洗脫進行純化得到化合物3（150 mg）。

C部分（120 g）采用同樣的方法脫色后，先用正相硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮（20∶1～1∶1）梯度洗脫，得到C1～C5。C5（12 g）利用反相柱色譜得到7個組分，其中的C5/3（1.7 g）再次利用正相柱色譜，氯仿-丙酮（20∶1、10∶1、2∶1、1∶1）梯度洗脫得到C5/3/1～C5/3/8。C5/3/2（120 mg）和C5/3/5（90 mg）分別用半制備反相色譜法，以甲醇-水（55%～75%）梯度洗脫，分別得到化合物5（18 mg）和6（15 mg）。

3 結構鑒定

13C譜和DEPT譜給出了除了4個乙酰氧基之外的5個季碳（其中1個酮羰基碳，1個2雜化的雙鍵季碳，3個骨架上的飽和季碳），8個次甲基（其中1個醛基，4個為氧化的次甲基對應4個乙酰氧基取代），5個亞甲基（含1個2雜化的環外亞甲基），2個角甲基，以上結構特征符合對映-貝殼杉烷-16-烯骨架含有環外雙鍵，5、9、13位3個次甲基，4、8、10位3個季碳，18、19、20位3個角甲基的特征（表1）。2D NMR譜中，H-1、H-5、H-9與醛基（C206.9 d）的HMBC相關說明是C-20被氧化為醛基（圖2）。另外的偕二甲基[H1.16 (3H, s, CH3-18)，H0.90 (3H, s, CH3-19)] 又和其中1個氧化次甲基（C79.3 d）相關，所以確定C-3位為乙酰氧取代，并且符合1H-1H COSY確定的H2-1/H2-2/H-3連續自旋系統。還有H-5/H-6和H-9/H2-11/H2-12/H-13/H-14的1H-1H COSY自旋系統，加上H-6與C-4、C-10，H-14與C-9、C-12的HMBC相關，共同確定了C-6、C-14位的乙酰氧取代。H-15與C-9和C-17的HMBC相關確定了C-15位的乙酰氧取代。而酮羰基與H-5、H-9、H-15的相關將羰基歸屬于C-7位。H-20與H-6、H-14、H3-19，H-15與H-13α的ROESY相關說明了H-6、H-14、CH3-19和H-15同C-20位醛基一樣處于環系的α-取向，H-3與CH3-18、CH3-19之間的NOE效應說明了H-3應該為椅式構象A環的平伏位置，即H-3也為α-取向。圖2中，在沒有氧橋、A環B環均為椅式構象的情況下，H-6α/H-5β之間偶合常數為13.5 Hz，佐證了二者相反的豎直取向。H-9β/H-5β的NOE效應證實了H-9同樣為β-取向。結合香茶菜屬植物中發現大量對映-貝殼杉烷二萜的經驗[1-4]，推斷化合物1的絕對構型也應該為對映-貝殼杉烷型，因此新化合物1被確定為C-20位氧化但未成環的對映-貝殼杉烷二萜，即3β,6β,14β,15β-四乙酰氧基-20-醛-對映-貝殼杉-16-烯-7-酮；經Sci-finder檢索，為1個新化合物，命名為建始冬凌草素J。

表1 化合物1的核磁共振數據(500/125 MHz,C5D5N)

圖2 化合物1的關鍵HMBC相關(HC)、1H-1H COSY相關()和ROESY相關 (HH)

化合物2：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 6.20 (1H, m, H-11α), 5.84 (1H, d,= 2.3 Hz, H-15α), 5.74 (1H, s, H-17a), 5.48 (1H, s, H-20), 5.42 (1H, s, H-17b), 5.39 (1H, s, H-14α), 4.18 (1H, t,= 5.1 Hz, H-6α), 3.97, 3.47 (各1H, m, CH3CH2O-20), 3.23 (1H, d,= 8.4 Hz, H-13α), 3.19 (1H, m, H-12a), 2.92 (1H, d,= 7.7 Hz, H-9β), 2.12 (1H, brd,= 12.4 Hz, H-1a), 2.04 (3H, s, OAc-11), 1.63 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5β), 1.11 (3H, t,= 7.0 Hz, CH3CH2O-20), 1.18 (3H, s, H3-18), 1.05 (3H, s, H3-19)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 29.9 (C-1), 19.2 (C-2), 41.8 (C-3), 34.6 (C-4), 58.5 (C-5), 73.9 (C-6), 101.6 (C-7), 54.0 (C-8), 46.9 (C-9), 40.4 (C-10), 68.8 (C-11), 41.7 (C-12), 48.0 (C-13), 77.0 (C-14), 73.4 (C-15), 159.5 (C-16), 110.5 (C-17), 34.1 (C-18), 23.3 (C-19), 102.0 (C-20), 170.7, 22.0 (3-OAc), 64.4, 15.8 (20-OCH2CH3)。以上數據與文獻報道基本一致[6]，故鑒定化合物2為川藏香茶菜素O。

化合物3：無色針晶（80%甲醇-水）。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 6.23 (1H, s, H-15α), 5.87 (1H, d,= 7.0 Hz, H-6α), 5.22 (1H, s, H-17a), 5.07 (1H, s, H-17b), 4.16 (1H, d,= 9.0 Hz, H-20a), 4.14 (1H, d,= 9.0 Hz, H-20b), 3.71 (1H, brs, H-1α), 2.31 (1H, d,= 7.0 Hz, H-5β), 1.23 (3H, s, H3-18), 1.02 (3H, s, H3-19), 2.15, 2.12 (6H, s, 2×OAc)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 65.3 (C-1), 26.8 (C-2), 34.3 (C-3), 33.8 (C-4), 50.1 (C-5), 75.4 (C-6), 95.7 (C-7), 51.2 (C-8), 38.9 (C-9), 40.9 (C-10), 15.3 (C-11), 31.9 (C-12), 37.0 (C-13), 27.6 (C-14), 75.4 (C-15), 160.0 (C-16), 108.7 (C-17), 33.2 (C-18), 23.6 (C-19), 66.4 (C-20), 171.3, 171.2 (2×OAc), 22.0, 21.4 (2×OAc)。以上數據與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物3為enmenin。

化合物4：無色針晶（80%甲醇-水）。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 6.18 (1H, s, H-15α), 5.78 (1H, d,= 6.9 Hz, H-6α), 5.21 (1H, s, H-17a), 5.08 (1H, s, H-17b), 4.80 (1H, brs, H-1α), 4.10 (1H, d,= 9.7 Hz, H-20a), 4.06 (1H, d,= 9.7 Hz, H-20b), 2.85 (1H, dd,= 12.7, 5.3 Hz, H-9β), 1.17 (3H, s, H3-18), 0.96 (3H, s, H3-19), 2.26, 2.11, 2.07 (各3H, s, 3×OAc)；13C- NMR (125 MHz, C5D5N): 70.1 (C-1), 23.6 (C-2), 34.6 (C-3), 33.7 (C-4), 50.8 (C-5), 74.6 (C-6), 95.5 (C-7), 51.2 (C-8), 38.8 (C-9), 39.6 (C-10), 15.2 (C-11), 31.5 (C-12), 36.9 (C-13), 27.6 (C-14), 75.1 (C-15), 159.5 (C-16), 109.0 (C-17), 32.8 (C-18), 23.2 (C-19), 65.3 (C-20), 171.0 (2×OAc), 170.2 (OAc), 22.0, 21.3, 20.9 (3×OAc)。以上數據與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物4為enmenin monoacetate。

化合物5：無色方晶（80%甲醇-水）。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 5.69 (1H, d,= 6.0 Hz, H-6α), 5.47 (1H, s, H-17a), 5.23 (1H, s, H-17b), 4.98 (1H, s, H-15α), 4.55 (1H, d,= 10.0 Hz, H-20a), 4.50 (1H, m, H-11α), 4.35 (1H, d,= 10.0 Hz, H-20b), 3.86 (1H, dd,= 12.4, 4.8 Hz, H-1β), 2.48 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9β), 2.73 (1H, m, H-13α), 1.61 (1H, d,= 6.0 Hz, H-5β), 1.10 (3H, s, H3-19), 0.82 (3H, s, H3-18), 2.15 (3H, s, OAc), 1.36 [6H, s, (CH3)2C]；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 73.7 (C-1), 26.5 (C-2), 39.5 (C-3), 33.6 (C-4), 54.9 (C-5), 75.3 (C-6), 95.9 (C-7), 52.5 (C-8), 47.7 (C-9), 40.3 (C-10), 63.7 (C-11), 39.9 (C-12), 36.8 (C-13), 27.3 (C-14), 74.8 (C-15), 161.1 (C-16), 108.3 (C-17), 31.7 (C-18), 22.4 (C-19), 64.5 (C-20), 169.3 (OAc), 21.4 (OAc), 100.8 [(CH3)2C], 24.8, 24.7 [(CH3)2C]。以上數據與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物5為乙酰化毛萼晶F。

化合物6：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 5.48 (1H, s, H-17a), 5.22 (1H, s, H-17b), 4.51 (1H, d,= 9.7 Hz, H-20a), 4.36 (1H, d,= 9.7 Hz, H-20b), 4.23 (1H, d,= 5.0 Hz, H-6α), 2.76 (1H, d,= 9.0 Hz, H-9β), 1.52 (1H, d,= 5.0 Hz, H-5β), 1.14 (3H, s, H3-19), 1.08 (3H, s, H3-18), 1.32, 1.28 [6H, s, (CH3)2C]；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 75.4 (C-1), 27.0 (C-2), 40.8 (C-3), 33.8 (C-4), 57.6 (C-5), 74.5 (C-6), 97.5 (C-7), 52.6 (C-8), 47.9 (C-9), 40.3 (C-10), 63.8 (C-11), 40.0 (C-12), 37.0 (C-13), 26.7 (C-14), 74.0 (C-15), 161.6 (C-16), 107.8 (C-17), 33.1 (C-18), 22.8 (C-19), 64.4 (C-20), 100.7 [(CH3)2C], 2×24.9 [(CH3)2C]。以上數據與文獻報道基本一致[9]，故鑒定化合物6為蕘花香茶菜乙素。

4 生物活性

為了尋找具有細胞毒活性的二萜化合物，對本次實驗所分離得到的除量極少的新化合物1之外的5個已知二萜化合物，進行了5種腫瘤細胞株（HL-60、SMMC-7721、A549、MCF-7、SW-480）的體外細胞毒活性實驗，但均無活性（IC50＞40 μmol/L），這與一般認為的D環α,β-不飽和酮結構是活性基團的認識相一致。

5 討論

之前的系統研究發現冬凌草中對映-貝殼杉烷型二萜的氧化程度普遍較高，且容易形成3α,20-環氧[10]、7α,20-環氧、11α,20-環氧[11]等多種氧橋，甚至是氮雜橋結構[12]，即便C-6、C-7位間發生斷裂生成延命素類或螺環內酯類時，C-20依然形成6,20-環氧[13]或7,20-環氧結構[10]，因而認為C-20氧橋和整個分子的籠狀結構能夠起到穩定平面結構和構象的作用。同時C-20大多表現為氧化度較低的-CH2O-片段，極少數表現為氧化度更高的半縮醛（如Pharicin N[6]）、縮醛結構（如化合物2），或者是進一步氧化的酯羰基（如rabdoternin A[6]）。此次發現的化合物1中C-20為孤立醛基，它可能是20位甲基氧化度由低升高，再形成半縮醛、縮醛（甚至氮雜縮合）、酯環的關鍵過渡態，只是由于游離羥基被乙酰化而阻止了氧橋的形成，因此能夠穩定存在而被幸運的發現。

萜類化合物，特別是香茶菜二萜一直是天然來源抗腫瘤分子研究的重點[14-15]，本研究對冬凌草的二萜類成分進行了深入研究，化合物2和4均為首次從該植物中分離，同時新化合物1中C-20氧化程度更高、更活潑的醛基可能預示著C-20形成更多氧橋、氮橋、其他縮合物或者多聚體的可能性，這些新發現為從冬凌草中找到更多具有抗腫瘤活性的二萜化合物、綜合利用鄂西地區冬凌草資源奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Sun H D, Huang S X, Han Q B. Diterpenoids fromspecies and their biological activities [J]., 2006, 23(5): 673-698.

[2] 劉楠, 李納, 馬曉華, 等. 中藥影響實驗性自身免疫性腦脊髓炎CD4+T細胞亞群分化的研究進展 [J]. 中草藥, 2021, 52(4): 1177-1184.

[3] 李小江, 鄔明歆, 孔凡銘, 等. 中藥有效成分抗腫瘤活性及作用機制研究進展 [J]. 中草藥, 2020, 51(9): 2587-2592.

[4] Liu M, Wang W G, Sun H D,. Diterpenoids fromspecies: An update [J]., 2017, 34(9): 1090-1140.

[5] Wen C M, Chen S, Yuan F,. Diterpenoids fromand their nitric oxide production inhibitory activity [J]., 2019, 9(69): 40628-40635.

[6] Hu Z X, Liu M, Wang W G,. 7α, 20-Epoxy--kaurane diterpenoids from the aerial parts of[J]., 2018, 81(1): 106-116.

[7] Mori S, Koizumi T, Shudo K,. Studies on the constituents ofKUDO. II. the structures of enmenin, enmelol, and ememodin [J]., 1970, 18(5): 884-889.

[8] Zhang J X, Han Q B, Zhao A H,. Diterpenoids from[J]., 2003, 74(5): 435-438.

[9] Wu S H, Zang H J, Chen Y P,. Diterpenoids from[J]., 1993, 34(4): 1099-1102.

[10] Liu X, Xue Y B, Dong K,. Three new ent-kaurane diterpenoids fromand their cytotoxicities [J]., 2012, 10(6): 464-470.

[11] Liu X, Zhan R, Wang W G,. Three new 11, 20-epoxy-ent-kauranoids from[J]., 2012, 35(12): 2147-2151.

[12] Liu X, Yang J, Wang W G,. Diterpene alkaloids with an aza--kaurane skeleton from[J]., 2015, 78(2): 196-201.

[13] Liu X, Wang W G, Du X,. Enmein-type diterpenoids from the aerial parts ofand their cytotoxicity [J]., 2012, 83(8): 1451-1455.

[14] 張金芳, 張曉瑞, 鄭敏思, 等. 葫蘆素類化合物的藥理作用研究進展 [J]. 醫藥導報, 2020, 39(12): 1710-1716.

[15] 卜蘭, 劉菲, 熊亮, 等. 益母草屬萜類化學成分及其藥理作用研究進展[J]. 世界中醫藥, 2020, 15(9): 1237-1246.

A new-kaurane diterpenoid from

LIU Xu1, 3, CHEN Chun-xia2, 3, WU Ji-zhou3

1. Department of Pharmacy, Tongji Hospital, Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430040, China 2. Wuhan Vocational College of Software and Engineering, Wuhan 430070, China 3. College of Pharmacy, Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430040, China

To investigate the chemical constituents fromcollected in the west of Hubei Province.Various column chromatography techniques were used to isolate and purify the compounds and their structures were identified by spectral data.From ethanol extract of plants in Jinshi County, six-kaurene diterpenoids were isolated and identified, of which one new compound 3β,6β,14β,15β-tetracetoxy-20-aldehyde--kaur-16-en-7-one (1), and other known ones as pharicin O (2), enmenin (3), enmenin monoacetate (4), acetonide of maoyecrystal F (5), and wikstroenioidin B (6).The new compound 1 named as jianshirubesin J is identified as a rare-kaurane diterpenoid in genusfor its oxygenated C-20 as an aldehyde instead of a common epoxy-bridge with C-3, C-7, or C-11. And compound 2 and 4 are isolated from this plant for the first time.

(Hemsley) H. Hara;-kaurane; diterpenoid; jianshirubesin J; pharicin O; wikstroenioidin B

R284.1

A

0253 - 2670(2021)23 - 7083 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.001

2021-06-11

湖北省自然科學基金（2020CFB616）

劉 旭（1985—），男，博士，研究方向為天然產物研究。Tel: 15827283993 E-mail: hustliuxu@aliyun.com

陳春霞，女，博士，主要從事天然藥物化學研究。E-mail: 2068639367@qq.com

[責任編輯 王文倩]