高烏甲素及其水解產物刺烏寧抗心律失常作用的比較研究

陶 培，王毓杰

高烏甲素及其水解產物刺烏寧抗心律失常作用的比較研究

陶 培，王毓杰*

成都中醫藥大學，四川 成都 611137

比較高烏甲素及其水解產物的心臟毒性及抗心律失?；钚?，明確C-4位芳香取代基對其活性和毒性的影響。采用堿水解、硅膠柱色譜以及波譜法對高烏甲素水解產物進行分離鑒定；采用心臟毒性實驗和烏頭堿誘發心律失常模型，比較高烏甲素及其水解產物的毒性和活性。分離并鑒定出高烏甲素水解產物為刺烏寧；股iv 2.40 mg/kg高烏甲素可引起大鼠出現室性早搏（ventricular premature beat，VPB）、室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）等心律失?，F象，刺烏寧在相同劑量下未出現心律失常現象；在抗心律失?；钚匝芯恐校邽跫姿亍⒋虨鯇幵诟髯缘膭┝糠秶鷥?，隨著劑量的增大，VPB潛伏期延長，VT發生率降低，心律失常完全抑制率逐漸升高，呈劑量相關性，表明兩者均有一定的抗心律失常作用，高烏甲素的作用強于刺烏寧。與高烏甲素相比，隨著C-4位芳香取代基的水解，水解產物刺烏寧的心臟毒性降低，抗心律失常活性明顯減弱，表明C-4位芳香取代基是高烏甲素產生心臟毒性、發揮藥效的關鍵基團。

高烏甲素；刺烏寧；抗心律失常；心臟毒性；C-4位芳香取代基

高烏甲素又名刺烏頭堿、拉巴烏頭堿，是從烏頭屬植物高烏頭Nakai中分離得到的一種C-18型二萜生物堿[1]，具有較強的鎮痛作用，且無成癮性，已被開發為非成癮性鎮痛藥，用于多種原因引起的疼痛[2-4]。在俄羅斯等國家，氫溴酸高烏甲素也作為臨床一線藥物治療室性早搏、心房顫動、室上性和室性心動過速等心律失常[4-6]。

二萜生物堿具有較強的神經毒性和心臟毒性，如烏頭堿可與神經細胞、心肌細胞膜上的電壓敏感型Na+通道特異性結合，促進Na+大量內流，細胞膜電位失衡，引起細胞功能紊亂，進而影響機體功能，出現四肢麻木、心律失常等中毒現象[7-8]。因此，烏頭類藥物需要炮制后使用。在水煮或蒸制過程中，烏頭堿的C-8位、C-14位依次通過水解反應生成苯甲酰烏頭原堿和烏頭原堿，隨著酯鍵的水解，2種水解產物的毒性和活性依次降低[9]，表明C-14位的苯甲?；?、C-8位的乙?；鶎τ跒躅^堿的毒性和活性具有重要作用。與烏頭堿相比，高烏甲素在C-14位沒有芳環取代基，但在C-4位連接有1個鄰乙酰氨基苯甲酰取代基，上述結構上的差異對高烏甲素毒性和抗心律失常活性的作用尚不清楚。

因此，本研究在堿性條件下水解高烏甲素C-4位的芳香環，采用色譜和波譜法對水解產物進行分離鑒定；采用心臟毒性實驗比較高烏甲素與水解產物的毒性差異；采用烏頭堿建立心律失常模型，比較高烏甲素與水解產物的抗心律失常活性，明確C-4位芳香取代基對高烏甲素心臟毒性及抗心律失?；钚缘挠绊?，為烏頭類藥物的炮制原理、炮制品的質量控制及二萜生物堿類抗心律失常藥物的研發提供思路。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠，雌雄兼用，7～8周齡，體質量180～220 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（川）-2020-030。實驗前適應性喂養2 d，自由進食飲水，室溫維持在20～25 ℃，晝夜光照及通風環境自然調節，實驗前禁食12 h。動物實驗經成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理備案號2020-15）。

1.2 藥品與試劑

高烏甲素（批號LRQ180116-1，質量分數＞98%）購自西安綠如泉生物科技有限公司；烏頭堿（批號WTZ10013，質量分數99%）購自陜西昊辰生物科技有限公司；刺烏寧（質量分數＞95%）為本課題組自制；鹽酸普羅帕酮（批號101190-201702，質量分數為99.8%）、鹽酸利多卡因（批號100341-201403，質量分數為93.4%）購自中國食品藥品檢定研究院；烏拉坦（批號2020041701）購自成都市科隆化學品有限公司；0.9%氯化鈉溶液（批號L219101908）購自四川科倫藥業股份有限公司；色譜用石油醚（沸點60～90 ℃）購自成都市科隆化學品有限公司；顯色劑為改良碘化鉍鉀試劑。

1.3 儀器

BL-420F型多功能生理記錄儀（成都泰盟軟件有限公司）；CPA2250型電子分析天平（德國Sartorius公司）；HH-SJ型集熱式磁力攪拌器（油浴用，金壇市城東新瑞儀器廠）；MicrO-TOF-Q-IImass spectrometer質譜儀、Avance 600 spectrometer核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；RE-3000B型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；薄層色譜硅膠G和柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工廠）。

2 方法

2.1 高烏甲素C-4位水解產物的制備與分離

取高烏甲素1.61 g，置500 mL圓底燒瓶中，加四氫呋喃130 mL使溶解，繼續加入2 mol/L NaOH 190 mL，115 ℃油浴回流6 h，取出，放涼，轉移至分液漏斗中，取四氫呋喃層，揮干溶劑，得1 g樣品，供柱色譜用。

將上述樣品用四氫呋喃溶解，拌樣，進行硅膠柱色譜（200～300目，80 g）分離，依次用3.3 L石油醚-丙酮-三乙胺（6∶1∶0.01）、1.4 L石油醚-丙酮-三乙胺（5∶1∶0.01）、1.5 L石油醚-丙酮-三乙胺（3∶1∶0.01）梯度洗脫，得到43個組分，薄層色譜檢視，合并組分34～40，重結晶，得到化合物1（450 mg）。

2.2 高烏甲素及水解產物的心臟毒性比較

取SD大鼠20只，隨機分為高烏甲素組和化合物1組，每組10只。大鼠ip 20%烏拉坦（1.2 g/kg）麻醉[10]，仰位固定，將針形電極插入四肢皮下，使用多功能生理記錄儀觀察大鼠II導聯心電圖20 min后，經股iv給藥，觀察給藥后30 min內心電圖變化。

通過前期預實驗，發現高烏甲素2.40 mg/kg可引起大鼠出現室性早搏（ventricular premature beat，VPB）、室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）、室顫（ventricular fibrillation，VF）等心律失?，F象。通過觀察高烏甲素和化合物1等劑量給藥后心電圖的變化，可直觀反映出C-4位芳香取代基對高烏甲素心臟毒性的影響[11-12]。

2.3 高烏甲素及水解產物的抗心律失?；钚员容^

取SD大鼠149只，隨機分為11組，見表1。取4 mL 1%鹽酸乙醇，0.9%氯化鈉溶液稀釋，用5% NaOH調pH至7，加0.9%氯化鈉溶液定容至100 mL，作為空白溶劑；各受試藥物均采用空白溶劑的配制方法進行配制。

表1 動物分組

大鼠ip 20%烏拉坦（1.2 g/kg）麻醉，仰位固定，將針形電極插入四肢皮下，記錄大鼠正常II導聯心電圖20 min后，暴露股靜脈，從股靜脈分別快速注射相應受試藥物，對照組和模型組給予空白溶劑。除對照組外，10 min后再從股靜脈快速注射烏頭堿（0.03 mg/kg）建立心律失常模型[15-19]，記錄30 min內各組大鼠心律失常的發生率、第1次出現VPB的時間以及是否出現心動過速[20-21]。

3 結果

3.1 化合物1的結構鑒定

化合物1：白色粉末，C23H37NO6。ESI-MS: 424.27 [M＋H]+；1H-NMR (600 MHz, CDCl3):1.06 (3H, t,= 7.32 Hz,-CH2-C3), 3.26 (3H, s, OCH3), 3.28 (3H, s, OCH3), 3.38 (3H, s, OCH3), 3.13 (1H, m, H-1), 3.39 (1H, d,= 4.8 Hz, H-14β), 2.91 (1H, s, H-17);13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 85.1 (d, C-1), 26.5 (t, C-2), 37.3 (t, C-3), 71.0 (s, C-4), 50.8 (d, C-5), 26.9 (t, C-6), 47.7 (d, C-7), 75.7 (s, C-8), 78.6 (s, C-9), 49.7 (d, C-10), 50.9 (s, C-11), 23.6 (t, C-12), 36.3 (s, C-13), 90.2 (d, C-14), 44.8 (t, C-15), 83.0 (d, C-16), 61.7 (d, C-17), 57.9 (t, C-19), 49.0 (t,-H2-CH3), 13.5 (q,-CH2-H3), 56.1 (q, 1-OCH3), 57.9 (q, 14-OCH3), 56.5 (q, 16-OCH3)。以上數據與文獻報道一致[22]，故鑒定化合物1為刺烏寧（圖1）。

圖1 高烏甲素及刺烏寧的化學結構

3.2 高烏甲素及水解產物的心臟毒性比較

2.40 mg/kg高烏甲素可引起正常大鼠出現VPB、VT和VF等心律失?，F象，高烏甲素致心律失常潛伏期為（131.2±56.1）s。在觀察期間內，高烏甲素組大鼠雖然未出現死亡的情況，但是均發生了VT、VF等致死性室性心律失常。而相同劑量下高烏甲素的水解產物刺烏寧組大鼠均未出現心律失?，F象。與高烏甲素相比，刺烏寧的心臟毒性明顯降低，表明C-4位鄰乙酰氨基苯甲酰取代基是導致高烏甲素產生心臟毒性的重要基團，醇胺型比單酯型二萜生物堿的心臟毒性更小，安全性更高。

3.3 高烏甲素及水解產物對烏頭堿誘發大鼠VPB潛伏期的影響

烏頭堿致心律失常模型大鼠的心電圖表現為：首先出現VPB，逐漸發展為二聯律或者三聯律，再進一步發展為陣發性和連續性室性心動過速等[13]。其中，VPB是心律失常模型大鼠的初期表現，心電圖特征為：QRS波群提前出現，形態寬大畸形，T波方向與QRS主波方向相反，并且P波消失[23]。VPB潛伏期是指注射完烏頭堿后到第1次出現VPB的時間，VPB潛伏期越長，表明受試藥物的抗心律失常作用越好。

對照組大鼠iv空白溶劑后，在整個觀察期間內，心電圖未發生變化。模型組大鼠經股iv烏頭堿后出現典型的VPB、VT，甚至有一部分大鼠出現VF，并且持續30 min以上，表明心律失常模型建立成功。如圖2所示，模型組大鼠VPB潛伏期為（116.5±36.4）s，利多卡因組大鼠VPB潛伏期為（280.3±128.7）s，普羅帕酮組大鼠VPB潛伏期為（193.3±39.9）s；與模型組相比，2個陽性對照藥物組均有顯著差異（＜0.05）。此外，利多卡因可以保護42.9%的大鼠不出現心律失常。

高烏甲素（0.01、0.05 mg/kg）組大鼠VPB潛伏期分別為（190.8±69.1）、（201.4±70.1）s，與模型組相比，無顯著差異。高烏甲素（0.15、0.20 mg/kg）組大鼠VPB潛伏期分別為（354.4±147.2）、（606.4±313.7）s，與模型組相比，均有顯著性差異（＜0.05）；與普羅帕酮組相比，高烏甲素（0.20 mg/kg）組大鼠VPB潛伏期有顯著性差異（＜0.05）。以上結果表明，在0.20 mg/kg劑量下，高烏甲素的抗心律失常作用明顯優于陽性對照藥物普羅帕酮。

與模型組比較：*P＜0.05；與普羅帕酮比較：#P＜0.05

刺烏寧（10、20 mg/kg）組大鼠VPB潛伏期分別為（164.5±59.7）、（234.4±106.9）s，與模型組相比，無顯著性差異。刺烏寧（40 mg/kg）組大鼠VPB潛伏期為（427.9±203.4）s，與模型組相比，有顯著性差異（＜0.05）。

通過對比高烏甲素和刺烏寧的劑量范圍可以發現，高烏甲素在0.15 mg/kg劑量下，可以有效延長VPB潛伏期；而刺烏寧在40 mg/kg劑量下才能顯著延長VPB潛伏期。刺烏寧發揮抗心律失常作用的劑量明顯高于高烏甲素，提示高烏甲素水解脫去C-4位芳香取代基后，抗心律失常作用降低。

3.4 高烏甲素及刺烏寧對烏頭堿誘發大鼠VT發生率的影響

VT是VPB進一步發展的結果，VT的心電圖特征為：連續出現3次或3次以上的VPB，QRS波群寬大畸形，無恒定的P波[24]。VT發生率可以評價受試藥物是否能夠阻止VPB的進一步發展，VT發生率越低，抗心律失常作用越好。

按照2檢驗的數據要求，需要將VT發生率相近的劑量組進行合并后，再分析各受試藥物不同劑量組對大鼠VT發生率的影響。因此，將高烏甲素（0.05、0.15 mg/kg）組合并為0.05～0.15 mg/kg劑量組；將刺烏寧（10、20 mg/kg）組合并為10～20 mg/kg劑量組。

高烏甲素最終分組為：0.01 mg/kg、0.05～0.15 mg/kg和0.20 mg/kg組。如表2所示，3個劑量組的VT發生率有差異（2＝11.481、＝0.003）。如圖3-A所示，與高烏甲素（0.01 mg/kg）組相比，高烏甲素（0.05～0.15、0.20 mg/kg）組大鼠VT發生率均顯著降低（2＝6.296、＝0.012；2＝7.736、＝0.005），分別為45.0%和30.0%。

刺烏寧最終分組為：10～20 mg/kg和40 mg/kg組。如表2所示，模型組和刺烏寧2個劑量組之間的VT發生率有差異（2＝10.974、＝0.004）。如圖3-B所示，與模型組相比，刺烏寧（40 mg/kg）組大鼠VT發生率顯著降低（2＝5.952、＝0.015）。

上述結果表明，高烏甲素和刺烏寧在各自的劑量范圍內，能夠降低VT發生率，阻止VPB的進一步發展。

3.5 高烏甲素及刺烏寧對烏頭堿誘發大鼠心律失常完全抑制率的影響

心律失常發生率[18]是指大鼠預先iv受試藥物，再用烏頭堿建立心律失常模型后，30 min內出現心律失常的大鼠比例（出現VPB、VT或VF中的任何一種心電圖變化，均算作出現心律失常）。心律失常完全抑制率即30 min內未出現心律失常的比例，可以評價受試藥物是否能夠完全抑制烏頭堿引起的心律失常，是最直觀反映受試藥物抗心律失常作用強弱的指標，心律失常完全抑制率越高，藥效越好。

表2 高烏甲素及刺烏寧VT發生率χ2分析

圖3 高烏甲素(A) 及刺烏寧(B) 對烏頭堿誘發大鼠VT發生率的影響

根據2檢驗的數據要求，將高烏甲素的0.05 mg/kg和0.15 mg/kg組、刺烏寧的10 mg/kg和20 mg/kg劑量組合并。

高烏甲素（0.01、0.05～0.15、0.20 mg/kg）組及利多卡因組的心律失常完全抑制率經2檢驗，結果見表3，4個組的心律失常完全抑制率有差異（2＝10.437、＝0.015）。如圖4-A所示，與高烏甲素（0.01、0.05～0.15 mg/kg）組相比，高烏甲素（0.20 mg/kg）組心律失常完全抑制率顯著升高（2＝7.038、＝0.008；2＝6.049、＝0.014），表明隨著劑量增大，高烏甲素的抗心律失常作用增強；在0.20 mg/kg劑量下，高烏甲素的心律失常完全抑制率為54.5%，高于利多卡因的42.9%，顯示出更強的抗心律失常作用。

如表3所示，刺烏寧（10～20、40 mg/kg）組及利多卡因組的心律失常完全抑制率也有顯著差異（2＝6.567、＝0.038）。如圖4-B所示，與刺烏寧（10～20 mg/kg）組相比，利多卡因的心律失常完全抑制率顯著升高（2＝6.435、＝0.011）。

表3 高烏甲素和刺烏寧心律失常完全抑制率χ2分析

圖4 高烏甲素(A) 及刺烏寧(B) 對烏頭堿誘發大鼠心律失常完全抑制率的影響

通過以上結果可以看出，高烏甲素和刺烏寧均能夠延長VPB潛伏期、降低VT發生率、提高心律失常完全抑制率，表現出一定的抗心律失常活性，且呈劑量相關性。若以各自的最優劑量表示受試藥物的抗心律失?；钚詮娙?，則高烏甲素在0.20 mg/kg劑量下，VPB潛伏期為（606.4±313.7）s，VT發生率為30%，可以保護54.5%的大鼠不出現心律失常；刺烏寧在40 mg/kg劑量下，VPB潛伏期為（427.9±203.4）s，VT發生率為40%，僅可以保護23.1%的大鼠不出現心律失常。由此可見，刺烏寧的抗心律失常藥效弱于高烏甲素。

4 討論

本研究采用堿水解法、硅膠柱色譜以及波譜法分離鑒定出高烏甲素的水解產物刺烏寧。為了明確C-4位芳香取代基對高烏甲素心臟毒性及抗心律失?；钚詮娙醯挠绊?，進一步采用了心臟毒性實驗及抗心律失常整體動物實驗對比兩者的毒性及活性。

心臟毒性實驗結果表明，2.40 mg/kg高烏甲素可引起大鼠出現室性早搏、室性心動過速和室顫；而相同劑量的刺烏寧組大鼠未出現任何心律失?，F象。高烏甲素是單酯型二萜生物堿，水解脫去C-4位鄰乙酰氨基苯甲?；笞優榇及沸投粕飰A，心臟毒性隨著結構的變化明顯降低。

烏頭堿誘發心律失常的機制為促進Na+通道開放，加速Na+內流，促使細胞膜去極化，加速起搏點自律性，縮短不應期[8,13]；而高烏甲素對心肌Na+通道的作用與烏頭堿相反，能夠可逆性地阻斷Na+通道的開放，從而產生抗心律失常的作用[5-6]。因此，本研究選擇了烏頭堿致心律失常模型研究高烏甲素及刺烏寧的抗心律失?；钚浴Ｓ捎诟邽跫姿氐目剐穆墒СＷ饔脵C制與Na+通道阻滯有關，其電生理特征接近于Ic類抗心律失常藥物[5]，因此，選擇了2種I類鈉通道阻滯藥（Ib類利多卡因和Ic類普羅帕酮）作為陽性對照藥物。

抗心律失?；钚詫嶒灲Y果表明，高烏甲素和刺烏寧均具有一定的抗心律失常作用。通過VPB潛伏期數據可以看出，高烏甲素的起效劑量（0.15 mg/kg）約是刺烏寧（40 mg/kg）的1/250。并且，高烏甲素在0.05～0.15 mg/kg劑量下，心律失常完全抑制率即可達到20.0%；而刺烏寧在40 mg/kg劑量下，心律失常完全抑制率為23.1%。也就是說，如果需要發揮同等的抗心律失常藥效，刺烏寧的所需劑量為高烏甲素的上百倍，表明C-4位芳香取代基是高烏甲素發揮抗心律失常作用的關鍵基團。

王培德等[18,25]發現sc小劑量（0.25～1.00 mg/kg）高烏甲素能夠延長VPB潛伏期，甚至可以保護大多數動物不出現心律失常；當靜脈恒速注射高烏甲素的累積量達（2.54±0.06）mg/kg時，會導致大鼠心率減慢，P-R間期延長；累積量繼續增至4.12～8.19 mg/kg時，可引起大鼠出現VPB、VT、VF等心律失?，F象，甚至死亡。本研究也發現，iv低劑量高烏甲素可出現較強的抗心律失常作用；當一次性快速注射2.40 mg/kg高烏甲素時，可引起VPB、VT、VF等心律失常現象，而同等劑量下，缺少C-4位取代基的刺烏寧則未出現上述現象。Dzhakhangirov等[26]發現單芳香胺型二萜生物堿的抗心律失常作用優于醇胺型，醇胺型二萜生物堿C-4位芳香化后，抗心律失常作用明顯增強，與本研究結果一致，即C-4位取代基是高烏甲素產生心臟毒性和發揮藥效的關鍵基團。此外，本研究在抗心律失常實驗中發現，隨著給藥劑量的增大，大鼠VPB潛伏期呈逐漸上升的趨勢，并且劑量越大，VPB潛伏期數據也更加分散，進而導致SD值較大?；诖耍殚喴恍┮訴PB潛伏期為指標的抗心律失?；钚詫嶒?，均發現了VPB潛伏期數據的SD值偏大的情況[19,25,27-28]。

本研究通過類比高烏甲素和烏頭堿的化學結構特點，推測C-4位鄰乙酰氨基苯甲?；赡芘c高烏甲素的抗心律失常活性有密切關系，并采用多種方法分離制備出高烏甲素的水解產物刺烏寧。通過心臟毒性和抗心律失?；钚詫嶒灒C實了C-4位芳香取代基是高烏甲素產生心臟毒性和發揮抗心律失常作用的關鍵基團，上述結果能夠為闡明含高烏甲素的烏頭類藥材的炮制原理、炮制品質控成分及二萜生物堿類抗心律失常藥物的研發提供思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on antiarrhythmic effect of lappaconitine and its hydrolysis product lappaconine

TAO Pei, WANG Yu-jie

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To compare the cardiotoxicity and antiarrhythmic activity of lappaconitine and its hydrolysate, and clarify the effect of aromatic substituent at C-4 position on activity and toxicity.The hydrolysis product of lappaconitine was separated and identified by alkaline hydrolysis, silica gel column chromatography and spectroscopic method. Furthermore, cardiotoxicity assay and aconitine-induced arrhythmia model were used to compare the toxicity and activity of lappaconitine and its hydrolysate.Lappaconine, the hydrolysate of lappaconitine, was isolated and identified. Intravenous injection of 2.40 mg/kg lappaconitine induced ventricular premature beat (VPB) and ventricular tachycardia (VT) in normal rats, but no arrhythmias were observed when administration of the same dose of lappaconine. In the study of antiarrhythmic activity, in the respective dose range of lappaconitine and lappaconine, they could dose-dependently delay the onset time of VPB, reduce the incidence of VT, combined with the increasing arrhythmia inhibition rate and exhibiting antiarrhythmic activities. Meanwhile, lappaconitine had a better antiarrhythmic effect than lappaconine.Compared with lappaconitine, with the hydrolysis of aromatic substituent group at C-4 position, the cardiotoxicity of hydrolysate lappaconine is reduced, and antiarrhythmic activity is obviously diminished, which demonstrates that the aromatic substituent at C-4 position is a key group for cardiotoxicity and antiarrhythmic effect.

lappaconitine; lappaconine; antiarrhythmic; cardiotoxicity; aromatic substituent at C-4 position

R285.5

A

0253 - 2670(2021)23 - 7214 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.015

2021-06-01

國家自然科學基金資助項目（81403104）；四川省科技廳省級科技計劃項目（2020YJ0131）；成都中醫藥大學“杏林學者”學科人才科研提升計劃（QNXZ2018042）

陶 培（1995—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術。Tel: 18223365150 E-mail: 1134119207@qq.com

王毓杰（1980—），男，副研究員，碩士生導師，研究方向為中藥及民族藥炮制原理。Tel: 18980923679 E-mail: superwangyj@126.com

[責任編輯 李亞楠]