根皮苷對食管癌細胞系表達譜的影響

楊照環，胡文倩，賈禎賢，謝俞寧，張 志*，龍月紅，邢朝斌，張雪梅, *

根皮苷對食管癌細胞系表達譜的影響

楊照環1，胡文倩2，賈禎賢2，謝俞寧2，張 志1*，龍月紅3，邢朝斌3，張雪梅2, 3*

1.華北理工大學附屬唐山市工人醫院，河北 唐山 063000 2.華北理工大學公共衛生學院，河北 唐山 063210 3. 華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063210

研究根皮苷對食管癌細胞系表達譜的影響，探索根皮苷作用于食管癌細胞系的信號通路及其潛在功能。使用根皮苷處理人食管癌KYSE450細胞，提取總RNA并建立測序文庫，進行轉錄組測序；使用DESeq2程序鑒定差異表達基因，對差異表達基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；使用MCODE進行差異基因核心模塊篩選，使用GEPIA數據庫分析核心模塊中的基因對食管癌生存的影響；使用TIMER在線分析根皮苷對食管癌組織免疫細胞浸潤的影響。轉錄組測序結果顯示，根皮苷處理后的食管癌細胞具有4602個差異表達基因，其中2407個為上調基因，2195個為下調基因。通路富集分析顯示，根皮苷對蛋白質加工、胰島素抵抗、基因復制和細胞周期等信號通路產生影響。在差異表達基因核心模塊中，E3泛素蛋白連接酶2（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2，）高表達可降低食管癌患者的總體生存率；環指蛋白19B（ring finger protein 19B，）、三重基序蛋白69（tripartite motif-containing protein 69，）、泛素連接酶（ubiquitin conjugating enzyme，）和克隆E3泛素連接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2，）的表達水平可影響食管癌癌組織的純度以及免疫細胞浸潤的類型。根皮苷可影響食管癌細胞的轉錄譜，其差異表達基因主要集中在細胞生長相關的信號通路。

根皮苷；食管癌；轉錄組測序；免疫浸潤；E3泛素蛋白連接酶2；環指蛋白19B；三重基序蛋白69；泛素連接酶；克隆E3泛素連接酶

當前癌癥仍是重要的公共衛生問題，在我國食管癌發病人數居于第6位，死亡人數居于第4位，給人民健康帶來巨大負擔[1]。食管癌致病因素復雜，抽煙[2]、酗酒[3]、胃食管反流[4]和遺傳因素[5-7]均是食管癌發病的重要原因。食管癌是全世界最致命的惡性腫瘤之一，新輔助放化療已被廣泛用于食管癌治療并取得了良好的效果[8]。但是，依然有60%的患者對新輔助放化療不敏感[9-10]，這無疑降低了手術的成功率，提示食管癌的治療離不開藥物的配合。

多穗石柯(Wall.) Rehd.在中國民間俗稱“甜茶”，根皮苷是甜茶的主要成分，是二氫查耳酮家族的重要成員，也是蘋果屬植物中的主要酚類葡萄糖苷，具有抗氧化、抗高血壓、抗糖尿病和抗腫瘤等作用。早在1993年，Nelson等[11]便發現了根皮苷具有抑制腫瘤細胞生長的作用；Chen等[12]發現三乙酰根皮苷能夠抑制腫瘤細胞系HepG2的增殖活性；根皮苷能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應來抑制順鉑對小鼠的腎毒性[13]，提示根皮苷具有抑制腫瘤和作為腫瘤治療輔助藥物的潛質。本課題組前期研究發現，根皮苷可顯著抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移[14]。為了進一步探索根皮苷影響食管癌進展的作用機制，本研究使用高通量測序技術，考察經根皮苷處理的食管癌細胞的轉錄組變化，以揭示根皮苷作用于食管癌細胞的信號通路和生物學功能，為根皮苷應用于食管癌治療提供轉錄組層面的證據。

1 材料

1.1 細胞株

人食管癌KYSE450細胞由日本兵庫醫學院的Y. Shimada博士饋贈。

1.2 藥材

多穗石柯甜茶葉采自中國廣西巴馬縣，經華北理工大學邢朝斌教授鑒定為殼斗科植物多穗石柯(Wall.) Rehd.的葉。

1.3 藥品與試劑

胎牛血清、RPMI 1640完全培養基購自美國Thermo Fisher Scientific公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Qubit RNA檢測試劑盒購自美國Life Technologies公司；NEBNext Ultra RNA庫制備試劑盒購自美國New England Biolabs公司。

1.4 儀器

細胞培養箱（中國力康生物醫療科技有限公司）；Acquity超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；分光光度計（美國Implen公司）；2100 Bioanalyzer系統（美國Agilent公司）。

2 方法

2.1 根皮苷的提取

將新鮮的甜茶葉干燥、過篩并浸入乙醇溶液中，超聲提取20 min，真空濾過，提取物濃縮去除乙醇，冷凍干燥得到粗產物。隨后，將5 g粗產物于水中溶解，并上樣于處理過的大孔樹脂柱中30 min。用去離子水洗滌大孔樹脂柱以除去雜質，并用75%乙醇洗滌根皮苷，將洗脫液濃縮，從乙醇中分離，于0 ℃重結晶。結晶產物濾過，得到根皮苷單體。使用超高效液相色譜儀測定根皮苷單體的質量分數≥95%。

2.2 細胞培養

KYSE450細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱培養。

2.3 細胞RNA提取及測序

取處于對數生長期的KYSE450細胞接種于6孔板中，2×105/孔，培養12 h。根皮苷溶于DMSO，由預實驗可知根皮苷半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為0.6 mmol/L，故使用略小于IC50的0.5 mmol/L根皮苷進行后續實驗。設置對照組和3個根皮苷（0.5 mmol/L）組，給藥組加入藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養48 h。

按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，使用分光光度計和Qubit 2.0 Flurometer中的Qubit RNA檢測試劑盒測定RNA純度和濃度；使用2100 Bioanalyzer系統評估RNA的完整性；使用NEBNext Ultra RNA庫制備試劑盒構建RNA測序文庫。使用Illumina Hiseq 4000測序平臺對構建好的文庫進行測序，測序完成后進行數據收集和處理，以上測序服務由北京百奧生物科技有限公司完成。

2.4 數據處理和差異分析

FASTQ格式的原始數據首先進行處理獲得clean data，使用TopHat軟件進行比對，使用Cufflinks軟件獲得各個基因的數值用于后續分析。使用R包“DESeq2”進行差異分析，將|Log2fold change|＞1和校正后＜0.05作為篩選差異基因的閾值，進行差異表達基因（differential expression genes，DEGs）的篩選；使用R包“ggplot2”“ggtree”進行熱圖繪制、聚類和各種可視化。

2.5 通路注釋和功能富集分析

對于DEGs，使用R包“clusterProfiler”和“enrichplot”進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，＜0.05認為差異具有統計學意義。

2.6 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建與關鍵DEGs的篩選

使用STRING數據庫（http://string-db.org/）進行網絡構建，使用Cytoscape軟件進行后續分析。使用Cytoscape內插件MCODE選擇包含做多節點數的基因集，根據MCODE分析結果，對各個module進行排序，排序最前的即為關鍵module，并使用Cytoscape軟件內置ClueGo插件對關鍵module內所含基因進行GO功能富集和KEGG通路分析。

2.7 DEGs的數據庫驗證與預后的關系

GEPIA包括了TCGA數據庫的測序數據，本研究使用GEPIA對DEGs在人群中的狀況進行驗證，并使用GEPIA中的預后分析模塊驗證基因表達對食管癌預后的影響，＜0.05認為差異具有統計學意義。

2.8 關鍵DEGs與免疫細胞之間的相關性

TIMER數據庫可用于計算6個浸潤免疫細胞（CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、B細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）與DEGs表達的相關性，對于與預后相關的DEGs，使用TIMER數據庫進行Spearman相關性計算，依次確認所研究基因與免疫細胞之間的相關性；相關系數值＜0.3表示相關可忽略，相關系數絕對值≥0.3表示具有正/負相關性，＜0.05認為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 根皮苷影響KYSE450細胞表達譜

通過測序和比對，除去表達過低的轉錄本，共得到15 339個基因。進行表達量差異分析，結果顯示共計4602個DEGs，可見約30%的基因表達發生了改變；其中2407個呈上調狀態，2195個呈下調狀態；DEGs中表達上調基因略多于表達下調基因（圖1-A）。基因表達聚類熱圖顯示，經過根皮苷處理后，3個重復的根皮苷處理組KYSE450細胞表達譜能夠聚類，且與對照組差異明顯（圖1-B），提示根皮苷處理組表達譜與對照組表達譜具有異質性。上述結果顯示，根皮苷能夠改變KYSE450細胞的表達譜。

3.2 DEGs的KEGG通路分析

將差異基因分為表達上調組和表達下調組，分別使用R包“clusterProfiler”進行KEGG通路分析，上調組和下調組通路富集＜0.05的結果見圖2，表達上調的DEGs主要影響了內質網中的蛋白質加工、胰島素抵抗、動物線粒體、ErbB信號通路和溶酶體等途徑；表達下調的DEGs主要影響了基因復制、細胞周期、同源重組、范可尼貧血途徑和Hippo信號通路。上述結果顯示，使用根皮苷進行處理后，KYSE450細胞的基因復制和細胞周期相關基因下調，而溶酶體通路、ErbB信號通路相關基因上調，這些基因與細胞的增殖和凋亡密切相關，提示根皮苷可能通過影響這些通路改變了KYSE450細胞的增殖水平，發揮了抑制食管癌細胞生長的作用。

3.3 DEGs的GO功能富集分析

使用R包“clusterProfiler”進行基因本體分析，GO功能富集結果＜0.05認為具有統計學意義，按照值進行排序，各取前5進行展示（表1、2）。對表達上調的DEGs分析結果顯示，這些基因在分子功能（molecular function，MF）層面影響了GTP酶結合等，細胞組分（cellular component，CC）層面影響了內質網-高爾基體中間區等，生物過程（biological process，BP）層面影響了細胞對未折疊蛋白的作用等；對于表達下調的DEGs分析結果顯示，在MF層面影響了單鏈DNA結合等，CC層面影響了染色體區域等，BP層面影響了基因復制等。

3.4 PPI網絡構建和關鍵模塊篩選

使用STRING數據庫構建了DEGs的PPI網絡，導入Cytoscape軟件進行分析，使用MCODE軟件確定PPI網絡中的核心模塊，前3個模塊見圖3，將排序第1的模塊為核心模塊，核心模塊1包含36個節點和630條邊，所含基因包括泛素結合酶E2H（ubiquitin conjugating enzyme E2H，）、環指蛋白41（ring finger protein 41，）和細胞因子信號抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，）等。

A-DEGs火山圖 B-DEGs熱圖

A-上調DEGs的KEGG通路分析 B-下調DEGs的KEGG通路分析

表1 上調DEGs的GO功能富集分析

表2 下調DEGs的GO功能富集分析

圖3 PPI網絡分析

將核心模塊1中的所有基因納入KEGG和GO分析，可見核心模塊1所含基因影響了熱量生成和蛋白質消化吸收相關信號通路（圖4-A），影響了細胞外基質強度結構成分、金屬羧肽酶活性和細胞色素C氧化酶活性及相關功能（圖4-B）。

3.5 關鍵模塊中預后和免疫細胞浸潤基因的鑒定

使用GEPIA數據庫研究核心模塊1中基因對食管癌預后的關系，發現在TCGA數據庫中，E3泛素蛋白連接酶2（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2，）基因呈高表達，且高表達是食管癌不良預后因素（圖5）。為了確定免疫細胞的腫瘤浸潤與免疫相關基因表達之間是否存在相關性，通過TIMER 2.0分析多個免疫細胞的腫瘤浸潤的情況，結果發現，表達與樹突狀細胞浸潤水平呈正相關，三重基序蛋白69（tripartite motif-containing protein 69，）表達與食管癌細胞純度呈負相關，泛素連接酶（ubiquitin conjugating enzyme，）表達與樹突狀細胞浸潤水平呈正相關，克隆E3泛素連接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2，）與巨噬細胞浸潤水平呈正相關（圖6）。

圖4 模塊1中基因的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

A-MIB2基因在食管癌組織中的表達情況箱線圖 B-MIB2基因表達對食管癌預后的影響

4 討論

轉錄組測序是重要的生物信息學方法，在癌癥患者篩查中得到廣泛應用[15]。本研究使用轉錄組測序技術研究根皮苷對食管癌細胞系表達譜的影響。結果顯示，根皮苷能夠改變KYSE450細胞的表達譜，其中2407個基因上調，2195個基因下調。對DEGs進行KEGG和GO分析，確定了這些差異基因影響了內質網中的蛋白質加工、胰島素抵抗、基因復制、細胞周期、GTP酶結合和單鏈DNA結合等功能。基因復制和細胞周期相關基因下調，提示根皮苷可能影響KYSE450細胞的復制過程，具有抑制食管癌細胞生長的潛力。既往研究也發現根皮苷能夠抑制皮膚癌細胞[16]、肝癌細胞[17]、乳腺癌細胞[18-19]等的增殖和凋亡。

圖6 關鍵模塊內基因表達與免疫浸潤水平的相關性

同時，本研究還構建了PPI網絡研究DEGs的互作用情況，核心模塊1中，高表達是食管癌不良預后因素，可介導Notch信號通路中蛋白的泛素化，并且能夠作為黑色素瘤侵襲的抑制劑[20]。Sahar等[21]研究發現，在子宮平滑肌瘤中表達上調，提示能夠作為子宮平滑肌瘤治療的潛在靶標，在食管癌中研究甚少，需要進一步探索。對核心模塊1內部的基因進行功能挖掘，發現細胞外基質強度結構成分、金屬羧肽酶活性和細胞色素C氧化酶活性等功能受到了影響；細胞色素C氧化酶作用失調被認為是癌癥、糖尿病等的致病和進展因素之一[22]，細胞色素C氧化酶相關基因在結直腸癌[23]、肺腺癌[24]和黑色素瘤[25]中具有差異表達，并具有一定的潛在治療價值，提示細胞色素C氧化酶相關功能的活性可能是食管癌進展的潛在生物標志物。

核心模塊1中的基因能夠影響食管癌的免疫微環境。本研究發現、、和對食管癌腫瘤組織浸潤的細胞類型和腫瘤純度均有影響。樹突狀細胞（DC細胞）是抗原呈遞細胞，包含多種亞型，可以駐留在器官中或在淋巴器官和非淋巴器官之間遷移。Sadeghzadeh等[26]認為DC細胞是刺激抗腫瘤免疫中的最關鍵的部分；大量研究顯示，DC細胞及其衍生物能夠應用于抗癌治療[27-30]。這些結果表明，根皮苷治療可能改變食管癌所處的免疫微環境，進而影響食管癌的發展進程。

綜上所述，本研究發現根皮苷能夠改變KYSE450細胞的表達譜，影響KYSE450細胞的復制、細胞色素C氧化酶活性等與癌癥進展關聯密切的功能，并影響食管癌免疫微環境。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Cao W, Chen H D, Yu Y W,. Changing profiles of cancer burden worldwide and in China: A secondary analysis of the global cancer statistics 2020 [J].: Engl, 2021, 134(7): 783-791.

[2] Cook M B, Kamangar F, Whiteman D C,. Cigarette smoking and adenocarcinomas of the esophagus and esophagogastric junction: A pooled analysis from the international BEACON consortium [J]., 2010, 102(17): 1344-1353.

[3] Pandeya N, Williams G, Green A C,. Alcohol consumption and the risks of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the esophagus [J]., 2009, 136(4): 1215-1224.

[4] Cook M B, Corley D A, Murray L J,. Gastroesophageal reflux in relation to adenocarcinomas of the esophagus: A pooled analysis from the Barrett’s and Esophageal Adenocarcinoma Consortium (BEACON) [J]., 2014, 9(7): e103508.

[5] Song Y M, Li L, Ou Y W,. Identification of genomic alterations in oesophageal squamous cell cancer [J]., 2014, 509(7498): 91-95.

[6] Lin D C, Hao J J, Nagata Y,. Genomic and molecular characterization of esophageal squamous cell carcinoma [J]., 2014, 46(5): 467-473.

[7] Gao Y B, Chen Z L, Li J G,. Genetic landscape of esophageal squamous cell carcinoma [J]., 2014, 46(10): 1097-1102.

[8] McNamara M J, Rybicki L A, Sohal D,. The relationship between pathologic nodal disease and residual tumor viability after induction chemotherapy in patients with locally advanced esophageal adenocarcinoma receiving a tri-modality regimen [J]., 2016, 7(2): 196-205.

[9] Allum W H, Stenning S P, Bancewicz J,. Long-term results of a randomized trial of surgery with or without preoperative chemotherapy in esophageal cancer [J]., 2009, 27(30): 5062-5067.

[10] Skinner H D, Lee J H, Bhutani M S,. A validated miRNA profile predicts response to therapy in esophageal adenocarcinoma [J]., 2014, 120(23): 3635-3641.

[11] Nelson J A, Falk R E. The efficacy of phloridzin and phloretin on tumor cell growth [J]., 1993, 13(6A): 2287-2292.

[12] Chen Y, Liu J, Geng S,. Lipase-catalyzed synthesis mechanism of tri-acetylated phloridzin and its antiproliferative activity against HepG2 cancer cells [J]., 2019, 277: 186-194.

[13] Un H, Ugan R A, Gurbuz M A,. Phloretin and phloridzin guard against cisplatin-induced nephrotoxicity in mice through inhibiting oxidative stress and inflammation [J]., 2021, 266: 118869.

[14] Jia Z X, Xie Y N, Wu H J,. Phlorizin from sweet tea inhibits the progress of esophageal cancer by antagonizing the JAK2/STAT3 signaling pathway [J]., 2021, 46: 137.

[15] Koeppel F, Bobard A, Lefebvre C,. Added value of whole-exome and transcriptome sequencing for clinical molecular screenings of advanced cancer patients with solid tumors [J]., 2018, 24(4): 153-162.

[16] Mantso T, Trafalis D, Botaitis S,. Novel docosahexaenoic acid ester of phloridzin inhibits proliferation and triggers apoptosis in anmodel of skin cancer [J]., 2018, 7(12): 188.

[17] Nair S V, Ziaullah, Rupasinghe H P. Fatty acid esters of phloridzin induce apoptosis of human liver cancer cells through altered gene expression [J]., 2014, 9(9): e107149.

[18] Fernando W, Coyle K, Marcato P,. Phloridzin docosahexaenoate, a novel fatty acid ester of a plant polyphenol, inhibits mammary carcinoma cell metastasis [J]., 2019, 465: 68-81.

[19] Fernando W, Coombs M R P, Hoskin D W,. Docosahexaenoic acid-acylated phloridzin, a novel polyphenol fatty acid ester derivative, is cytotoxic to breast cancer cells [J]., 2016, 37(10): 1004-1013.

[20] Takeuchi T, Adachi Y, Sonobe H,. A ubiquitin ligase, skeletrophin, is a negative regulator of melanoma invasion [J]., 2006, 25(53): 7059-7069.

[21] Sahar T, Nigam A, Anjum S,. Interactome analysis of the differentially expressed proteins in uterine leiomyoma [J]., 2019, 19(10): 1293-1312.

[22] Arnold S. The power of life—Cytochrome c oxidase takes center stage in metabolic control, cell signalling and survival [J]., 2012, 12(1): 46-56.

[23] Hewedi I H, Farid R M, Sidhom K F,. Differential expression of cytochrome C oxidase subunit I along the colorectal adenoma: Carcinoma progression [J]., 2018, 26(9): 689-696.

[24] Mishra N, Timilsina U, Ghimire D,. Downregulation of cytochrome c oxidase subunit 7A1 expression is important in enhancing cell proliferation in adenocarcinoma cells [J]., 2017, 482(4): 713-719.

[25] Gandhirajan R K, R?dder K, Bodnar Y,. Cytochrome C oxidase inhibition and cold plasma-derived oxidants synergize in melanoma cell death induction [J]., 2018, 8(1): 12734.

[26] Sadeghzadeh M, Bornehdeli S, Mohahammadrezakhani H,. Dendritic cell therapy in cancer treatment; the state-of-the-art [J]., 2020, 254: 117580.

[27] Pitt J M, André F, Amigorena S,. Dendritic cell-derived exosomes for cancer therapy [J]., 2016, 126(4): 1224-1232.

[28] Saxena M, Bhardwaj N. Re-emergence of dendritic cell vaccines for cancer treatment [J]., 2018, 4(2): 119-137.

[29] Giovanelli P, Sandoval T A, Cubillos-Ruiz J R. Dendritic cell metabolism and function in tumors [J]., 2019, 40(8): 699-718.

[30] Li W, Song X, Yu H,. Dendritic cell-based cancer immunotherapy for pancreatic cancer [J]., 2018, 19(1): 1-6.

Effect of phlorizin on expression profile of esophageal cancer cell lines

YANG Zhao-huan1, HU Wen-qian2, JIA Zhen-xian2, XIE Yu-ning2, ZHANG Zhi1, LONG Yue-hong3, XING Zhao-bin3, ZHANG Xue-mei2, 3

1. Affiliated Tangshan Gongren Hospital, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China 2. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China 3. School of Public Health, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China

To evaluate the effect of phlorizin on expression profile of esophageal cancer cells and further to reveal the signal pathways and potential functions that phlorizin involved in.KYSE450 esophageal cancer cells were treated with phlorizin. Total RNA was extracted and RNA sequencing library was established to perform transcriptome sequencing. Differentially expressed genes were identified using DESeq2 package. Gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis of differentially expressed genes were performed. Moreover, hub model was evaluated using MCODE and survival analysis was performed using GEPIA. TIMER was used to online analyze effect of phlorizin on immune cell infiltration in esophageal cancer tissue.Total 4602 differentially expressed genes were identified of which 2407 were up-regulated and 2195 were down-regulated. Pathway enrichment analysis showed that phlorizin had impact on protein processing, insulin resistance, DNA replication and cell cycle signaling pathways. In the hub module, high expression of E3 ubiquitin ligase mind bomb 2 () could reduce the overall survival rate of patients with esophageal cancer; Ring finger protein 19B (), tripartite motif-containing protein 69 (), ubiquitin conjugating enzyme () and homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2 () expression levels could affect the purity of esophageal cancer tissue and type of immune cell infiltration.Phlorizin could affect the transcription profile of esophageal cancer cells, of which differentially expressed genes were mainly involved in signal pathways related to cell growth.

phlorizin; esophageal cancer; RNA-Seq; immune infiltration; MIB2; RNF19B; TRIM69; UBC; HECTD2

R285.5

A

0253 - 2670(2021)23 - 7236 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.018

2021-06-08

國家自然科學基金資助項目（81272613）

楊照環（1975—），女，碩士，副主任醫師，主要研究領域為腫瘤內科的綜合治療。Tel: 13831553045 E-mail: 244107878@qq.com

張雪梅，博士生導師，主要從事腫瘤病因學與腫瘤流行病學研究。E-mail: jyxuemei@gmail.com

張 志，碩士生導師，主要從事腫瘤內科的綜合治療研究。E-mail: zhi1969@163.com

[責任編輯 李亞楠]