掌葉大黃RpNAC1基因的克隆、亞細胞定位及表達分析

梁小燕，李元敏，李依民，李 慧，杜 鵑，張明英，高 靜，彭 亮，張 崗

? 藥材與資源 ?

掌葉大黃基因的克隆、亞細胞定位及表達分析

梁小燕，李元敏，李依民*，李 慧，杜 鵑，張明英，高 靜，彭 亮，張 崗*

陜西中醫藥大學藥學院 陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心，陜西 西安 712046

克隆掌葉大黃轉錄因子基因，進行生物信息學、亞細胞定位及表達模式分析。根據轉錄組中一個NAC unigene，利用RT-PCR克隆開放閱讀框（open reading frame，ORF）。通過生物信息軟件預測基因編碼蛋白的理化性質、結構域等分子特征。采用DNAStar 6.0和MEGA 7.0分別進行氨基酸序列比對和進化分析。構建綠色熒光蛋白（GFP）融合表達載體，以農桿菌侵染煙草葉片的瞬時表達法分析亞細胞定位。運用qRT-PCR檢測基因表達模式。分離到基因，ORF（1269 bp），編碼一個由422個氨基酸組成的蛋白質，相對分子質量47 070，等電點5.80，包含一個保守NAC結構域（32～181），與多種植物NAC蛋白一致性較高（62.42%～88.7%），聚在植物NAC分子進化樹的NAC2分支，與甜菜NAC（XP_010694507）親緣關系較近。RpNAC1-GFP融合蛋白定位在煙草細胞核內。基因在一年生植株根中表達量最高，根莖中表達量最低，相對表達量分別為葉中的5.37、0.012倍；該基因響應200 μmol/L赤霉素（gibberellin，GA3）處理后在24 h內總體上調，200 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理1 h和12 h基因顯著上調，200 μmol/L水楊酸（salicylic acid，SA）處理12 h顯著誘導基因表達，200 μmol/L脫落酸（abscisic acid，ABA）處理抑制基因表達，200 μmol/L乙烯（ethylene，ET）處理未見明顯變化。獲得掌葉大黃基因序列及表達特征，為進一步研究其在蒽醌類成分合成與積累中的轉錄調控作用提供支撐。

掌葉大黃；NAC轉錄因子；基因克隆；表達模式；激素

中藥資源的生產與其所處的生態環境有密切關系。藥用植物在長期適應環境過程中，不斷積累遺傳變異特征，成為中藥材品質形成的重要條件[1]。遺傳與環境互作在調控藥用植物次生代謝物合成與積累方面發揮重要作用[2]。隨著現代生物技術的發展，通過轉錄水平對藥用植物活性成分合成途徑進行調控，能夠定向且高效調節活性成分的生產。轉錄因子可調控細胞代謝途徑基因表達，在植物生長發育、逆境適應和系統進化方面發揮重要作用[3]。NAC（NAM、ATAF、CUC）是植物中特有的一大類轉錄因子，在植物器官分化、衰老、次生代謝以及生物或非生物脅迫等方面中都有重要調控功能[4-5]。現已從模式植物和農作物等多種植物中鑒定到大量NAC基因，如擬南芥中有138個、水稻中有328個、小麥中有134個、煙草中有42個等[6]。藥用植物NAC研究剛起步，僅有丹參[7]、穿心蓮[8]、三七[9]等相關報道，在活性成分合成與積累及激素信號通路介導的逆境脅迫方面起關鍵調控作用。因此，藥用植物NAC基因發掘及其功能解析研究亟待加強。

掌葉大黃L.是中藥材大黃的基原之一，味苦，性寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經之功效[10]，臨床應用廣泛。迄今為止，已從大黃中分離到蒽醌、蒽酮、二苯乙烯、類黃酮、酰基葡萄糖苷和吡喃酮等多種化學成分[11]。蒽醌類為大黃主要活性成分，具有抗腫瘤[12]、保肝[13]等藥理活性。蒽醌類成分積累是決定大黃藥材質量的關鍵因素。掌葉大黃主要分布在甘肅、青海等高海拔地區，高光強、低溫、強輻射等極端環境使其進化形成一套遺傳調控適應機制。隨著大黃蒽醌類成分生物合成途徑的解析[14]，有助于下一步研究蒽醌類成分的積累和調控。課題組前期對一年生掌葉大黃根、根莖和葉片比較轉錄組測序（SRR10855670），并從中鑒定到一個NAC家族成員基因Cluster-7329.62847（1794 bp），包含完整開放閱讀框（open reading frame，ORF），與植物NAC家族成員序列相似性較高（＞61%）。鑒于NAC在植物次生代謝調控中的重要作用，本研究進行基因克隆、生物信息學、亞細胞定位及組織和響應激素的表達模式，為下一步研究其在蒽醌類成分合成中的作用及應答植物激素的分子機制提供科學依據。

1 材料

1年生掌葉大黃系課題組于2019年10月采自甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉麻界村（東經104°10′4.98″，北緯34°16′50.9″，海拔2377 m），經陜西中醫藥大學胡本祥教授鑒定為掌葉大黃L.。取大黃根、根莖、葉3個部位樣品，液氮速凍后置?80 ℃超低溫冰箱保存備用。本氏煙Domin由本實驗室保存。

2 方法

2.1 樣品的處理

參考黑小斌等[15]建立的方法培養大黃無菌實生苗。選取生命旺盛、長勢均勻的1月齡幼苗，分別噴施200 μmol/L的赤霉素（gibberellin，GA3）、乙烯（ethylene，ET）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）激素作為處理組，以不含激素的溶劑模擬噴施作為模擬處理對照組（Mock），材料以0 h為空白對照，所有樣品重復3次，分別于處理后1、3、6、12、24 h取處理和Mock組葉片樣品，液氮速凍后置?80 ℃冰箱保存備用。

2.2 總RNA提取及cDNA合成

使用植物RNA提取試劑盒RN38（艾德萊，北京）提取掌葉大黃各樣品的總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用K5800自動檢測超微量分光光度計（凱奧，中國）檢測RNA濃度和純度；使用PrimeScript? RT Master Mix反轉錄試劑盒（TaKaRa公司，中國）合成cDNA第一鏈，?20 ℃保存備用。所有操作均按試劑盒說明書進行。

2.3 基因克隆

以掌葉大黃轉錄組NAC基因Cluster-7329.62847 ORF為模板，設計RT-PCR引物，RpNAC1-ORF-F：5’-ATGGGGTTTGAGCCACCG- 3’，RpNAC1-ORF-R：5’-CTACGCTTCTCGCCGTT- GAG-3’。以RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用?DNA Polymerase（TaKaRa公司，中國）進行擴增。PCR體系為25 μL：0.125 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 16.375 μL。PCR擴增條件：預變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，34個循環，72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。將PCR特異性片段經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國）回收，連入pUC19載體（TaKaRa公司，中國）后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，隨機選取3個帶有目的產物的陽性克隆質粒，送由楊凌天潤奧科生物科技有限公司完成測序。

2.4 RpNAC1生物信息學分析

用NCBI在線比對分析RpNAC1序列相似性分析；利用ExPASy（https://www.expasy.org/）進行RpNAC1蛋白質相對分子質量、理論等電點和親、疏水性的在線分析；分別用SignalP4.1（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM軟件進行蛋白信號肽與跨膜區分析；ProtScale軟件分析蛋白親水性；用SOPMA預測蛋白二級結構。Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/ plant-multi/）和WolfPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位分析；借助DNAStar 6.0進行多序列比對，運用MEGA 7.0采用相鄰連接法（neighbour-joining，NJ）構建多種植物NAC蛋白的系統進化樹。

2.5 RpNAC1蛋白亞細胞定位分析

為研究RpNAC1蛋白在植物細胞中的定位情況，在ORF擴增引物兩端分別加入Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位點：RpNAC1orf-GFP-F：5’-CTATCCA TGGGGTTTGAGCCACCG-3’和RpNAC1orf-GFP- R：5’-CTCCTCCGCTTCTCGCCGTG-3’，克隆連接至pCAMBIA1302（華越洋）構建重組載體，CaCl2法轉入農桿菌感受態細胞EHA105（上海唯地），倒置培養2 d，挑取陽性克隆接種到含有抗生素的5 mL LB培養基中，28 ℃，200 r/min培養至菌液渾濁，用5 mL農桿菌緩沖液洗滌3次，稀釋至菌體濃度（600值）為200時，避光靜置2 h。選擇長有8葉左右的本氏煙的第2～4葉，快速撕取內表皮，平鋪于MS固體培養基，25 ℃下暗培養36 h。農桿菌注射法將質粒pCAMBIA1302-GFP、pCAMBIA1302-RpNAC1-GFP轉化到內表皮，25 ℃共培養36 h后，用10 μg/mL DAPI染色20 min，再用pH 7.2的磷酸緩沖液清洗3次，制片，用Olympus FV3000激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）觀察。

2.6 RpNAC1基因表達分析

利用實時熒光定量PCR分析在1年生掌葉大黃不同組織部位和一月齡幼苗葉片經激素處理下的表達特征。利用NCBI BLAST分析和PrimerPremier 5.0軟件設計qRT-PCR引物：RpNAC1-qPCR-F：5’-GATTCCCGTGTTGATGAT- TCTG-3’和RpNAC1-qPCR-R：5’-CTCGTATCTTA- GCCTCTTGTTTGG-3’，擴增產物長度207 bp。以β-actin為內參基因，β-actin-F：AGGGTCCA- ATGCTTTATC，β-actin-R：CAGTCTTCTCCACCA- CAA。使用TB Green?? II（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司，中國）進行qPCR。20 μL反應體系：2×TB Green?? II（Tli RNaseH Plus）10 μL，Forward/Reverse Primer各0.8 μL，cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應程序：預變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，延伸60 ℃、34 s，40個循環，融解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。同時繪制熔解曲線，包括不加模板的對照在內，所有qRT-PCR反應技術重復和實驗重復各3次，利用StepOnePlus?Real-Time（Applied Biosystems公司，美國）進行qRT-PCR檢測，以2???Ct法計算相對表達量。

3 結果與分析

3.1 RpNAC1基因克隆

以掌葉大黃無菌苗的cDNA為模板，利用RpNAC1-ORF-F/R進行RT-PCR。擴增產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得清晰明亮的單條帶（圖1）。目標條帶經克隆測序獲得1269 bp的序列，與原Cluster-7329.62847 ORF一致，序列分析結果表明其編碼NAC蛋白，故命名為（GenBank登錄號MW269549）。

圖1 RpNAC1 RT-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

3.2 RpNAC1理化性質、結構域

Protparam預測RpNAC1基因編碼的蛋白質的分子式為C2082H3266N568O644S16，相對分子質量為47 071.21，理論等電點為5.80，RpNAC1蛋白帶正電殘基（Asp＋Glu）為51，帶負電殘基（Arg＋Lys）為57。該蛋白的不穩定系數為53.79，脂肪系數為72.37，親水性系數為?0.581。SOPMA分析表明，RpNAC1蛋白二級結構主要由α螺旋（alpha helix，29.15%）、隨機卷曲（random coil，56.87%）、延伸鏈（extended strand，8.53%）和少量的β轉角（beta turn，5.45%）組成。

InterProScan與PROSITE分析結果一致，顯示RpNAC1蛋白有一個保守蛋白結構域：32～181（NAC），PROSITE SCAN分析表明該蛋白中包含5個-糖基化位點（102～105、236～239、275～278、300～303、322～325）、1個cAMP-和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點（414～417）、7個蛋白激酶C磷酸化位點（110～112、141～143、259～261、306～308、384～386、391～393、417～419）、8個酪蛋白激酶II磷酸化位點（41～44、65～68、118～121、160～163、226～229、277～280、331～334、401～404）、1個酪氨酸激酶磷酸化位點（84～91）、4個-豆蔻酰化位點（103～108、132～137、222～227、318～323）、1個酰胺化位點（146～149）。

使用SignalP 4.1和TMHMM在線分析一致表明該蛋白無信號肽或跨膜域，同時Plant-mPLoc和WolfPSORT一致預測RpNAC1定位在細胞核。

3.3 蛋白多序列比對和系統進化

借助DNAStar 6.0中的MegAlign對目的蛋白和其他NAC家族植物蛋白進行多序列比對。圖2分析結果顯示，RpNAC1 ORF編碼的蛋白質序列與剛毛檉柳L.（AGV29495）、藜麥Willd.（XP_021761189）、菠菜L.（XP_021864947）、甜菜subsp. Vulgaris （XP_010694507）、擬南芥L.（NP_566376）、擬南芥（NP_196061）、大豆L.（XP_003546832）等NAC蛋白的相似性較高，分別為87.88%、74.29%、73.30%、73.03%、68.42%、66.84%、62.42%。

圖2 RpNAC1蛋白與其他植物NAC蛋白的多序列比對

從NCBI下載擬南芥、水稻、丹參、大豆和甜菜等植物NAC蛋白家族成員，采用MEGA7.0軟件N-J法對19個NACs及RpNAC1蛋白構建系統進化樹（圖3）。從圖中可以看出，RpNAC1聚在植物NAC家族的NAC2亞類，與剛毛檉柳NAC（AGV29495）和甜菜NAC（XP_010694507）蛋白親緣關系最近。

圖3 RpNAC1與其他植物NAC蛋白的進化樹分析

3.4 RpNAC1蛋白的亞細胞定位

用激光共聚焦顯微鏡觀察本氏煙葉片表皮細胞。圖4結果顯示，RpNAC1-GFP融合蛋白在煙草細胞核中顯熒光，說明RpNAC1定位在細胞核。

3.5 RpNAC1基因組織特異性表達分析

分別提取一年生掌葉大黃根、根莖、葉總RNA，利用qRT-PCR檢測不同組織部位中的基因表達（圖5）。圖5可以看出，基因轉錄本在一年生植株根中表達豐度最高，相對表達量為葉中的5.37倍，莖中表達量最低，為葉中的0.012倍。

圖4 RpNAC1蛋白在煙草葉肉中的亞細胞定位

圖5 RpNAC1在不同組織器官中的表達模式

3.6 RpNAC1基因的誘導表達分析

qRT-PCR分析顯示，1月齡幼苗Mock組1 h葉片中迅速下調至空白對照的0.40倍，其他時間點變化不顯著；ABA顯著抑制表達，24 h恢復至0 h表達量水平；ET處理基因表達未見明顯變化；響應GA3處理后在24 h內總體上調，且在誘導處理24 h時表達量達到最高，為空白對照的3.09倍；響應MeJA處理在1、12 h呈雙峰式誘導，分別為空白對照的7.52、4.94倍；SA處理12 h時基因表達量達到最高，為CK的5.06倍，見圖6。

4 討論

NAC是植物中已報道的一大類重要轉錄因子，其家族成員數量龐大，在擬南芥和水稻等模式植物中研究較多[16]，藥用植物中也有零星報道，參與植物生長發育、次生代謝和逆境適應等生物學過程。本研究以前測序獲得的轉錄組數據為基礎，克隆獲得ORF，與多種植物NACs基因一致性較高，編碼蛋白包含一個NAC結構域，符合NAC蛋白結構特征[17]。Plant-mPLoc預測與亞細胞定位結果表明，RpNAC1蛋白是核定位蛋白，作為轉錄因子行使其調控功能。分子進化上RpNAC1屬于植物NAC分子進化樹的NAC2亞類，該亞類相關基因與植物抗逆性密切相關[16]，推測RpNAC1可能具有類似功能。

NAC基因在不同植物、不同組織中或不同發育階段的表達模式通常存在差異[9]。擬南芥NAC1在根、莖、葉中表達水平變化大，根中表達量最高，在莖和葉中表達量相對較低[18]。Li等[19]在藜麥中鑒定了90個，11個表現出明顯的組織特異性表達模式，基因主要在莖中表達，而、、和基因在葉片中表達水平較高，、、23、、和基因在根中具有較高的表達水平。本研究組織表達分析結果表明基因在一年生掌葉大黃根中表達水平最高，暗示其可能在根中發揮重要的轉錄調控功能。轉錄因子通常能響應外源激素處理從而通過激素信號轉導參與植物次生代謝與脅迫反應等生物學過程。研究表明NAC基因啟動子區常含有多個響應激素和逆境脅迫的元件，如基因啟動子區有ABA、MeJA、SA、逆境脅迫順式作用元件[20]。外源SA、ET和MeJA處理可提高基因的轉錄水平[21]。ANAC019通過正調控ABA信號轉導參與調節擬南芥種子萌發和幼苗發育[22]。本研究結果顯示，對5種外源激素處理的響應有差異。ABA處理顯著抑制基因表達，說明ABA為負調控信號，和陸地棉的表達模式相似[23]。ET處理未顯著引起基因表達水平變化，說明可能不受乙烯信號調控。基因響應GA3處理后在24 h內總體上調，說明該基因參與赤霉素信號轉導途徑。SA是一種天然植物激素信號分子，在調節植物對生物和非生物脅迫的反應中發揮重要作用[24]。基因受SA處理后在12 h顯著上調，與受SA誘導響應方式一致[25]。MeJA外源處理在誘導藥用植物活性成分積累和防御反應方面起關鍵作用[8-9]，基因響應MeJA處理呈雙峰式誘導，說明MeJA正調控基因的特殊性和復雜性。響應不同激素的差異表達特征，對于后續研究其在大黃蒽醌類成分生物合成中的作用以及應答植物激素的分子機制具有重要意義。

圖6 RpNAC1基因在不同激素處理下的表達模式

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning, subcellular localization, and expression analysis offrom

LIANG Xiao-yan, LI Yuan-min, LI Yi-min, LI Hui, DU Juan, ZHANG Ming-ying, GAO Jing, PENG Liang, ZHANG Gang

Shaanxi Qinling Chinese Herbal Medicine Application Development Engineering Technology Research Center, School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China

To clone a NAC transcription factor genefrom Dahuang () followed by bioinformatics, subcellular localization and expression pattern analysis.According to a NAC transcription factor unigene in transcriptome, the open reading frame (ORF) was cloned by RT-PCR. The physical and chemical properties, protein structure, and other molecular characteristics of the deduced protein RpNAC1 were predicted by bioinformatics tools. DNAStar 6.0 and MEGA7.0 were used for multiple sequence alignment and phylogenetic tree analyses, respectively. Green fluorescent protein (GFP) fused expression vector was constructed and subcellular localization ofwas observed bytransient expression method in tobacco. Quantitative PCR was employed for gene expression analyses.The ORF ofwas 1269 bp in size, encoding a 422-aa protein with a molecular weight of 47 070 and an isoelectric point of 5.80. The deduced RpNAC1, containing a conserved NAC domain (32—181). RpNAC1 protein was highly consistent with other plant’s NAC proteins (62.42%—88.7%), and was clustered in NAC2 subclass of plant NAC molecular phylogenetic tree, and was closely related toNAC (XP_010694507). The RpNAC1-GFP fusion protein was located in the nucleus of tobacco mesophyll cells. The qRT-PCR analyses showed that the abundance ofgene was the highest in roots and the lowest in rhizomes, and the relative expression levels were 5.37 and 0.012 times higher than those in leaves ofseedlings at one-year stage. After 200 μmol/L gibberellin (GA3) treatment,transcript was up-regulated within 24 h. Methyl jasmonate (MeJA, 200 μmol/L) treatment for 1 h and 12 h significantly up-regulated its expression level. Salicylic acid (SA, 200 μmol/L) treatment also significantly induced gene expression. Whereas, Abscisic acid (ABA, 200 μmol/L) treatment inhibited gene expression and 200 μmol/L ethylene (ET) treatment did not show any effects.The sequence and expression characteristics ofgene were obtained, which will provide the reference for further study on the biological function of the gene in the biosynthesis and accumulation regulation of anthraquinones in.

L.; NAC transcription factor; gene cloning; expression pattern; hormone

R282.12

A

0253 - 2670(2021)23 - 7302 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.024

2021-05-10

國家自然科學基金資助項目（82104334）；陜西中醫藥大學校級課題（2020PG29）；陜西中醫藥大學新進博士科研啟動經費（104080001）；陜西中醫藥大學學科創新團隊項目（2019-QN01）；中央本級重大增減支項目（2060302）

梁小燕，女，碩士研究生，研究方向為藥用植物生物技術與分子生物學。E-mail: 1446200532@qq.com

李依民，女，博士，副教授，研究方向為中藥資源評價與利用。E-mail: 2051058@sntcm.edu.cn

張 崗，男，博士，教授，研究方向為中藥資源評價與利用。E-mail: jay_gumling2003@aliyun.com

[責任編輯 時圣明]