植物類原球莖的研究進展

梁如意 朱文怡 朱同瑤 郭思夢 周芳美

（浙江中醫(yī)藥大學 醫(yī)學技術學院，浙江 杭州 310053）

在對蘭科植物的組織培養(yǎng)過程中，種子萌發(fā)時期內所形成的一種形態(tài)學組織結構稱為原球莖，而外植體如莖尖、葉片等被誘導形成的與原球莖相似的脫分化組織，稱為類原球莖或擬原球莖，即PLBs。一般情況下，兩者均可再生出完整的植株幼苗。但類原球莖[1]由于增殖速度快、生長周期短、具有很強的根、芽分化能力和較高的抵御外部惡劣環(huán)境能力，因此可實現(xiàn)蘭科植物的規(guī)模化生產，且其形態(tài)發(fā)育和對物質代謝的潛能與原植物相同，彌補了植物繁殖周期長、自身條件限制等缺點。對類原球莖的離體培養(yǎng)是現(xiàn)下很多植物實現(xiàn)快速繁殖的途徑，并且對類原球莖的離體培養(yǎng)也一直是現(xiàn)下植物培養(yǎng)的研究熱點。本文主要對近幾年來影響植物類原球莖離體培養(yǎng)的因素及其應用的研究進展進行了綜述，旨在進一步開發(fā)利用類原球莖，推動我國花卉和中藥材產業(yè)的發(fā)展。

1 類原球莖的離體培養(yǎng)

植物離體培養(yǎng)技術與方法是指通過無菌操作分離植物體的一部分器官或其它組織的片段即外植體，將其接種在人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件下進行離體培養(yǎng)最終獲得再生植株或目的產品。目前對PLBs的離體培養(yǎng)的研究主要從以下幾個主要角度進行展開：外植體材料的選擇、培養(yǎng)基的篩選、植物生長調節(jié)劑的調節(jié)、天然有機物與碳源的影響、光照的影響。

1.1 外植體的選擇

大量研究表明，目前能夠誘導產生PLBs的植物材料有莖尖、莖段、根莖、葉片、原球莖等。莖尖是最早被廣泛應用于誘導產生類原球莖的外植體材料，1960年Morel[2]在對大花蕙蘭苗莖尖脫毒組培時，意外發(fā)現(xiàn)可由莖尖分生組織誘導形成類似某種子萌發(fā)狀態(tài)的組織結構，即類原球莖，由此開啟了通過類原球莖方式實現(xiàn)植物快速繁殖的新時代。王澤祺等[3]以石斛“火鳥”莖尖為材料，成功誘導出類原球莖并實現(xiàn)了其植株再生。然而雖然莖尖分化能力強、遺傳穩(wěn)定性高，但莖尖誘導形成類原球莖難度大。因此目前學者通常采用其它的外植體來誘導產生類原球莖。

莖段是近幾年來常用于誘導產生類原球莖的外植體。焦展等[4]采取“二加二”方法研究金線蓮組培苗的莖段后發(fā)現(xiàn)，莖段的平均誘導率最高可達88.33%。Xiu Hu等[5]在研究姜花植株再生時，發(fā)現(xiàn)莖部成熟節(jié)段外植體96%以上都能夠誘導產生類原球莖，植株成活率高，這也是首次證明類原球莖可再生姜花，為姜花的體外繁殖提供了新的途徑。然而通過莖段誘導產生類原球莖容易受到植物激素濃度等因素的影響。以鐵皮石斛莖段為材料來誘導產生類原球莖時發(fā)現(xiàn)，受所添加的激素配比的影響，莖段更容易被誘導產生不定芽和不定根，誘導產生類原球莖的效果不佳[6]。

葉片也是常用來誘導產生類原球莖的外植體。羅劍飄等[7]以麒麟火焰蘭葉片及根莖為材料發(fā)現(xiàn)，葉片比根莖更容易誘導產生類原球莖，以葉片作為外植體，誘導率最高能達到63%，而以根作為外植體，很難誘導產生類原球莖。因此，不同植物中所最適合用來誘導產生類原球莖的外植體并不完全相同，在通過類原球莖方式進行再生植株培育時，能否正確選擇合適的外植體是直接決定實驗成敗的關鍵因素之一。

1.2 基礎培養(yǎng)基的篩選

在植物類原球莖的培養(yǎng)過程中，較為常見的培養(yǎng)基有MS培養(yǎng)基、KC培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、VW培養(yǎng)基等，為植物類原球莖的生長發(fā)育提供了所需的營養(yǎng)物質及無機鹽，目前最常用的是MS培養(yǎng)基。

王澤祺等[3]在類原球莖誘導過程中，配制了不同水平MS、1/2MS和KC的基礎培養(yǎng)基，結果顯示，類原球莖誘導的最適的基礎培養(yǎng)基為MS。樊家榮等[8]以1/2MS作為類原球莖誘導增殖的基礎培養(yǎng)基，效果良好。Khoddamzadeh等[9]測試了1/2MS和VW培養(yǎng)基，根據(jù)類原球莖的存活率和增殖數(shù)量，得出1/2MS培養(yǎng)基的效果更好。基礎培養(yǎng)基的選擇是影響植物類原球莖的生長的重要因素之一，研究證明MS培養(yǎng)基具有巨大的優(yōu)勢。

1.3 植物生長調節(jié)劑的影響

植物生長調節(jié)劑作為植物生長發(fā)育過程中的重要調控因子，對類原球莖的快速繁殖和發(fā)育起到關鍵作用，目前常用的植物生長調節(jié)劑有 6-BA、NAA、IBA、2，4-D、TDZ、KT 等。TDZ 作為一種新型的植物生長調節(jié)劑，具有很強的CTK活性。TDZ在蘭花的離體再生中，具有較強的抗病性、較高的增殖活性并且對器官發(fā)生的積極反應，低濃度的 TDZ有利于誘導產生 PLBs，培育再生植株，而濃度高則會抑制植株芽的伸長[10]。Bhattacharyya 等[11]在對石斛培養(yǎng)的研究中也驗證了這一點。王澤祺等[3]通過設置不同濃度梯度的NAA，對石斛“火鳥”類原球莖進行增殖分化，結果顯示一定濃度NAA會影響類原球莖的增殖質量。但有些植物使用激素組合來培養(yǎng)的效果更好，楊國鵬[12]發(fā)現(xiàn) 6-BA 和 NAA 組合對白及和蝴蝶蘭類原球莖的誘導增殖效果最佳。黃霞等[13]添加TDZ和2，4-D誘導出了文心蘭原球莖。因此各種植物生長調控劑的品種和數(shù)量以及不同的配比在各種植物組織培養(yǎng)過程中對原球莖的生長和發(fā)育效果并非完全相同，在對不同植物進行培養(yǎng)時，選擇合適的植物激素或組合對類原球莖培養(yǎng)至關重要。

1.4 天然有機物的影響

在長期實踐中，研究人員已經發(fā)現(xiàn)一些含有酶、氨基酸和微量元素的天然有機物能夠促進類原球莖的生長發(fā)育，如土豆汁、椰汁、香蕉汁等，因此添加適量的天然有機物有利于植物的組織培養(yǎng)，在優(yōu)化植物快速繁殖體系中具有極大潛力。

胡艷梅等[14]在深入探究5種天然有機物對大花蕙蘭類原球莖增殖分化的影響時，以椰汁、香蕉汁等為變量，結果表明，椰子汁、香蕉汁對類原球莖的增殖分化有促進作用，其中以香蕉汁效果最好。方中明等[15]在基礎培養(yǎng)基中添加濃度梯度香蕉汁、馬鈴薯汁和蘋果汁，發(fā)現(xiàn)添加香蕉汁和蘋果汁的培養(yǎng)基上類原球莖的增殖效果較差，添加一定濃度馬鈴薯汁有利于類原球莖的增殖，其中以200 g/L馬鈴薯汁對鐵皮石斛類原球莖的增殖效果最好，而肖小軍[16]的研究中得出250 g/L 土豆汁增殖效果最好。因此，添加天然有機物對類原球莖的快速繁殖有一定的積極作用，而其種類和最佳濃度還需進一步研究。

1.5 光照的影響

在調節(jié)類原球莖發(fā)生的幾個因素中，黑暗條件被認為是誘導產生類原球莖的重要因素[15]。在對鐵皮石斛PLBs的誘導研究匯總發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下培養(yǎng)產生的鐵皮石斛PLBs呈淡黃色，分散性良好，適宜進行類原球莖下一步的懸浮培養(yǎng)，然而黑暗條件對PLBs的生長存在一定的抑制作用[17]，因此目前大量研究使用12-16h光周期誘導產生PLBs。類原球莖在大量繁殖過程中可能會出現(xiàn)體細胞無性系變異，采用紅光和遠紅光的結合可以有效解決這個問題[18]。光的類型可以優(yōu)化類原球莖再生體系，使用紅色和白色LED結合蔗糖作為碳水化合物源，或者藍色和白色LED結合海藻糖作為碳水化合物源，對于類原球莖再生成完整植株具有最好的響應[19]。在不同的光照條件下，類原球莖中的化學成分含量有所差別。在對鐵皮石斛的研究中發(fā)現(xiàn)，在外界光照強度≥2000lx時類原球莖生物量最高，在光照強度下培養(yǎng)30d后發(fā)現(xiàn)其多糖含量最高，而生物堿量則在500lx光照強度下培養(yǎng)最佳。

1.6 防褐化技術

褐化是目前植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的一大難題。植物組織被切割后，在切口處的產生酚類化合物易被氧氣氧化成褐色的醌類物質，植物體內酚與酚之間的平衡就被打破。并且醌類物質能夠抑制植物體內的其它酶活性，當其蔓延至整個培養(yǎng)基后，會導致培養(yǎng)基發(fā)生變色甚至導致植物體死亡，所以褐化被普遍認為是植物組培過程中的三個重要問題之一[2]。

目前，在常用的防褐化物質有檸檬酸、抗壞血酸及活性炭等物質。活性炭作為一種表面吸附劑，既能夠有效吸收各種不利于細胞生長發(fā)育的褐化物質，同時也會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質。所以采用活性炭防褐化的同時，要注意調節(jié)活性炭濃度。李艷敏[20]等人對蝴蝶蘭葉片誘導產生的類原球莖進行了防褐化研究，研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的防褐化效果最好，檸檬酸在一定程度上也可以防褐化，活性炭處理實驗組中沒有觀察到有類原球莖產生，猜測是因為活性炭濃度過高吸附了過多植物體生長必須的營養(yǎng)物質。

2 類原球莖玻璃化低溫冷凍保存

目前，對于植物類原球莖的保存多采用玻璃化低溫保存法。玻璃化法主要是將要保存的材料添加一定量高濃度的冷凍保護劑后投入液氮中的保存方法，材料在液氮中被快速冷凍，使組織和器官進入玻璃化狀態(tài)，避免細胞和組織中出現(xiàn)冰晶從而造成損傷。它主要包括材料的選擇、預培養(yǎng)、裝載、玻璃化、液氮凍存、化凍與洗滌、活性檢測與恢復培養(yǎng)等方面，其多應用于類原球莖的保存，但此方法也存在一定的弊端。

Suhana Zakaria等[21]在對沙賓石斛藍原球莖樣體（PLBs）低溫保存研究中通過生化分析發(fā)現(xiàn)在冷凍保存時期，沙賓石斛藍原球莖樣體中葉綠素、類胡蘿卜素和卟啉含量與對照相比普遍降低，PLBs再生能力有所下降，并且高濃度的低溫保護劑也可能對外植體產生一定的毒性。這說明此種方法對類原球莖有一定的損傷。王春浩[22]以文心蘭類原球莖為材料進行玻璃化超低溫保存研究，發(fā)現(xiàn)在適宜的干燥預處理與處理時間條件下，類原球莖的存活率高，并且預處理在改變材料生理狀態(tài)的同時也能夠降低裝載、玻璃化、冷凍和化凍過程給類原球莖所造成的傷害。玻璃化超低溫冷凍保存作為類原球莖保存種質資源常用的方法，在蘭科植物種質資源保護方面發(fā)揮著巨大作用。

3 類原球莖的應用

3.1 快速繁殖

在植物的快速繁殖中，類原球莖充當著中間繁殖體，在適宜條件下可分化培養(yǎng)出新的植株，實現(xiàn)植株再生。并且PLBs具有增殖速度快、生長周期短等優(yōu)點，相較于常規(guī)的植物組織培養(yǎng)能夠明顯縮短植物的培育周期，實現(xiàn)規(guī)模化生產，因此已經成為部分蘭科植物工業(yè)化生產的重要形式。陳常理等[23]將金線蘭的莖段誘導成類原球莖實現(xiàn)了金線蘭的快速繁殖。袁芳等[6]成功將石斛莖段誘導成類原球莖，實現(xiàn)了鐵皮石斛的高效再生。因此，類原球莖的快速繁殖對于植物的商業(yè)化生產和瀕危植物的保護有重要意義。

3.2 人工種子

人工種子是指通過組織培養(yǎng)技術將從植物材料中誘導出的類似于合子胚的體細胞胚或者不定芽等包埋于人工制作的具有保護功能的種皮內。在人工種皮和體細胞胚之間裝載能夠提供營養(yǎng)物質的人工胚乳，在適宜環(huán)境的條件下，人工種子可以萌發(fā)成長為完整的植株，類原球莖就是一種蘭科植物組培過程中出現(xiàn)的類似于種子中合子胚的結構[24]。基于此原理，將類原球莖應用到植物的人工種子制作中就成為了解決植物在自然情況下繁殖率低的辦法。虎頭蘭是一種繁殖率低且繁殖周期長的植物，付雙彬等[25]證明了在適宜激素和營養(yǎng)物質的條件下，將類原球莖包埋制成人工種子，萌發(fā)率高達48%，并且絕大部分都可形成完整的植株。

3.3 種質資源保存

蘭科植物由于具有極高藥用價值與觀賞價值，近年來一直飽受人們的青睞。但目前由于我國對蘭科植物花卉市場缺乏規(guī)范管理，加上人為的炒作，使得野生蘭科資源的破壞十分嚴重。為了保護蘭科植物的基因多樣性，迫切需要對植物種質資源的保存方法進行創(chuàng)新。傳統(tǒng)的植物離體保存技術主要是對植物莖尖、種子或花粉等材料進行冷凍保存，保存工序復雜。而植物的類原球莖具有體積小、植株再生能力強、成苗容易等優(yōu)點，因此可將其作為優(yōu)質植物種質資源保存的一種材料。

3.4 藥用次生代謝產物

近年來，藥用次生植物代謝產物供不應求，但是多數(shù)藥用植物人工栽培生長周期長、繁殖率低、藥用次生代謝產物產量低且易受環(huán)境氣候的影響，所以將類原球莖的離體培養(yǎng)技術應用于生產植物藥用次生代謝產物具有重要意義[26]。由于類原球莖具有易分散、增殖效率高、生長周期短、分化后可得到大批量幼苗的特點，并且它們還具備與原植物相同的形態(tài)發(fā)育和物質代謝潛能，所以可以將其應用于藥用次生代謝產物的生產。在鐵皮石斛和金釵石斛等兩種蘭科植物中，類原球莖也被廣泛用來提高生物活性化合物的含量，與其母株相比，從類原球莖微繁殖植物中提取的次生代謝產物如酚類、黃酮類和生物堿等的產量更高[27]。

3.5 其他應用

有研究發(fā)現(xiàn)，類原球莖在基因工程上也發(fā)揮著一定作用。于璇[28]以蝴蝶蘭的類原球莖為供試材料，pCAMBIA1301為植物表達載體，EHA105的根癌農桿菌為菌株，通過農桿菌介導法成功構建了蝴蝶蘭類原球莖轉基因體系。并且近年來關于植物類原球莖的研究報道涉及類原球莖的誘導、增殖、分化、植物再生等多方面，并逐步形成一套完整的類原球莖快速繁殖體系，對于深入研究植物類原球莖，并為其一步的開發(fā)利用提供了基本條件。

4 展望

類原球莖是植物離體過程中產生的類似種子萌發(fā)的過渡形態(tài)，具有易分散、生長周期短、增殖速度快、抗逆能力較強、可實現(xiàn)規(guī)模化生產等優(yōu)點，目前石斛類蘭科植物通過類原球莖方式快速繁殖體系基本已經完善，然而對于類原球莖在獨蒜蘭等瀕危蘭科植物方面還并未見相關的研究報道，因此還需要不斷對類原球莖的特點進行更深入的研究，將其應用擴大化。通過建立完整的類原球莖培養(yǎng)體系，不僅能夠瀕危植物的保護和開發(fā)利用具有促進作用，也可以進一步推動我國花卉和中藥材產業(yè)的發(fā)展。此外，還能用于商業(yè)性植物的培養(yǎng)中，實現(xiàn)其工業(yè)化量產，大大節(jié)約成本和時間，具有更高的經濟效益，滿足其在花卉、藥材等方面極大的市場需求量。