淺談蜂王漿中抗生素殘留檢測方法

王 琦，陳東海，王進州，張 發，王 志

（吉林省養蜂科學研究所，吉林 吉林 132108）

抗生素是由微生物或高等動植物在低濃度下分泌的小分子天然有機化合物，是能夠干擾其他細胞發育功能的化學物質[1]，具有一定的抑菌或殺菌作用。抗生素按照化學結構大致可分為β-內酰胺類、喹諾酮類、四環素類、氨基葡糖苷類、大環內酯類、多肽類等[2]；而按照用途又可分為人用抗生素和獸用抗生素兩種，被廣泛應用于醫療、畜牧業、水產養殖等領域。蜂病是蜜蜂養殖業的棘手問題之一，而抗生素的出現大大降低了蜂病所帶來的損失。如美洲幼蟲腐臭病、白堊病、微孢子蟲病等蜜蜂常見疾病均可通過抗生素得到有效控制或治療。

有研究表明，抗生素類藥物的吸收率并不高，約有85%的抗生素會經受藥者新陳代謝而排出體外[3]。蜂王漿是經由蜂巢內哺育蜂的頭部腺體分泌到體外的分泌物，因此在蜂王漿生產期間（或前不久） 使用抗生素類藥物，可使抗生素殘留在蜂王漿內。陳昌利等[4]研究發現，給蜂群飼喂250 mg 四環素后50 d，蜂王漿中的四環素殘留才能完全達標，土霉素則需要60 d。雖然按照規定用法定量使用抗生素能夠將蜂王漿內的抗生素含量控制在合格（安全） 水平，但在養蜂生產上濫用抗生素的現象卻層出不窮[5]。這主要歸結于獸藥抗生素具有防治動物疫病和促進生長的雙重功效[6]。這些抗生素在一系列傳遞后最終排放到環境中，可引起致病菌獲得抗生素耐藥性等不利影響[7]。因此，在蜂王漿銷售前，嚴格的抗生素檢測措施是必不可少的，而如何方便、快速、精準的定性定量分析蜂王漿中的抗生素殘留一直是該領域的研究重點。本文對蜂王漿中抗生素殘留的幾種主要檢測方法進行了綜述。

1 蜂王漿中的抗生素殘留

20 世紀40 年代，青霉素的發現在第二次世界大戰中大放異彩，它優異的抗菌消炎功效拯救了無數人的生命。而在隨后的70 多年間，各種各樣的抗生素類藥物被廣泛應用在醫療、獸醫、養殖等領域。抗生素類蜂藥一經問世便被諸多養蜂者視為“萬能藥”，相伴而生的便是盲目用藥、過量用藥、防病用藥、生產期用藥等一系列不科學用藥，出現“藥殘”現象，嚴重影響蜂產品品質[8]。養蜂業常用的抗生素類藥物主要有：青霉素、頭孢菌素、林可霉素、四環素、鏈霉素、紅霉素、替米考星、土霉素、金霉素、多西環素、喹諾酮類、卡那霉素、氯霉素、泰樂菌素、β-內酰胺等。如鹽酸土霉素可用于治療美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病、使用制霉菌素治療白堊病、煙曲霉素治療孢子蟲病等[9]。

2 檢測方法

2.1 液相色譜法

液相色譜法是一種分析速度快、分離效能高、自動化的分析方法，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應用范圍廣等優點，是蜂王漿內抗生素殘留的主要檢測方法。裝置由固定相和流動相組成，固定相置于色譜柱中，種類繁多，如吸附劑離子交換樹脂等；流動相為各種溶劑。待測樣隨流動相進入色譜柱后，因各組分間對固定相的吸附能力、分配系數等因素的差異（因固定相種類而定） 使得各組分從色譜柱中流出時間不同，從而實現組分的分離。然后各組分進入檢測器（紫外、熒光、示差折光檢測器和質譜儀） 中進行定量分析。

物質均由一種或多種元素組成，而不同元素之間的差異便是核電荷數不同，因此兩個不同元素的離子質量存在差異。質譜法是將樣品電離轉化為氣態離子后根據其不同的質荷比大小分離并進行分析。質譜儀靈敏度高、結構分析性能強，除對待測樣品進行獨立定性或定量分析外，還可作為高效液相色譜的檢測器使用，即高效液相色譜- 質譜法（HPLC-MS 或LC-MS）。

GB/T21164-2007[10]中規定了液相色譜法檢測蜂王漿中鏈霉素、雙清鏈霉素殘留量的方法，該方法使用庚烷磺酸鈉-磷酸鈉混合液提取，C18 為固定相，甲醇為流動相，經熒光檢測器檢測，使用外標法定量。周碧青等[11]使用高效液相色譜法測定了蜂王漿中3 種四環類抗生素殘留，該方法采用Na2EDTA-Mellvaine 緩沖液提取后經SPE 固相萃取純化，使用紫外檢測器進行測定。

而在國標法中，液相色譜法-串聯質譜法得到了廣泛應用。如GB/T 22945-2008[12]中使用該方法將鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素提取后經苯磺酸型和羥酸型固相萃取柱，串聯質譜儀檢測蜂王漿中三種抗生素殘留。Zhang 等[13]使用pH 6.0 磷酸鹽緩沖液提取,經HLB 小柱凈化富集后,采用高效液相色譜- 串聯質譜法對蜂王漿中紅霉素及其代謝產物進行了分析。此外，林可霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素[14]（GB/T 22946-2008）、土霉素、四環素、金霉素、多西環素[15](GB/T 23409-2009)等抗生素均可采用液相色譜法-串聯質譜法檢測。

3.2 酶聯免疫法

酶聯免疫法是一種特殊的試劑分析方法，試劑主要包括固相的抗體或抗原、酶標記的抗體或抗原、顯色劑三部分，因酶具有高的催化頻率，該方法具有高的靈敏度。酶聯免疫法使用酶分子標記抗體或抗原（保留抗體或抗原免疫學特性的同時又保留了酶的活性） 與固相的抗體或抗原特異性結合，通過顯色液發生顯色反應，根據溶液的顏色變化對待測樣進行定性或定量分析。

邢淑婕[16]使用自制的土霉素酶聯免疫檢測試劑盒檢測了蜂王漿中土霉素殘留含量，發現所有樣品中均有土霉素殘留，殘留量可達到農業農村部規定的限量標準；此外，平行使用的結果表明，酶聯免疫法的靈敏度遠高于TLC 法（薄層色譜法）。趙暉等[17]使用四環素酶聯免疫檢測盒測定了出口蜂產品中抗生素含量，結果表明當蜂蜜和蜂王漿中四環素濃度為0.025 mg/kg 時，10 次檢測均為陽性，可滿足對出口蜂王漿的檢測要求（四環素含量<0.05 mg/kg），不存在漏選的現象。行業標準SN/T 2058-2008[18]、SN/T 2059-2008[19]和SN/T 2060-2008[20]中也規定了使用酶聯免疫法檢測蜂王漿中氯霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素和泰樂菌素殘留的所需儀器、試劑和操作規范等。

2.3 放射受體分析法

該方法與酶聯免疫法類似，受體（具有特定氨基酸序列和構型的蛋白質） 可與使用放射性核素標記的配體發生特異性結合，通過非標記配體與標記配體對受體的競爭關系，根據已知的非標記配體濃度來推知待測樣品濃度[21]。

SN/T 2664-2010[22]中采用放射受體分析法檢測了蜂王漿中四環素類抗生素殘留，標記配體為[3H]標記的金霉素，將提取出的四環素類抗生素稀釋后與配體共同競爭結合特異的受體位點，經反應后加入閃爍劑測定β 粒子數放射性量值，計數cmp 值，該值與蜂王漿中四環素殘留呈反比。

3 展望

簡要綜述了幾種蜂王漿中抗生素殘留的檢測方法，其中高效液相色譜法在蜂王漿抗生素殘留的檢測中使用最為廣泛，可檢測絕大多數抗生素，精度高、出峰快。該方法的短板主要在于儀器的檢測器，高效液相色譜的檢測器大致可分為紫外檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器和質譜儀幾種，其中紫外、熒光檢測器為選擇型檢測器，只對特定的待測樣品響應，其他待測樣無響應或響應過小，不具備普適性；而且示差折光檢測器對樣品濃度具有較高要求，不能使用梯度洗脫；相較而言，質譜儀更適合作為檢測器使用（這也是絕大多數的檢測方法或標準使用高效液相色譜-質譜法的原因），但其價格昂貴，售價都在幾十萬元至上百萬元不等。目前關于酶聯免疫法和放射受體分析法檢測蜂王漿中抗生素殘留的研究相對較少。尤其是放射受體分析法，在國內文獻中，目前筆者僅找到了使用該方法檢測四環素的相關文獻。