當前我國豬偽狂犬病的流行及疫苗應用

李少麗，胡曉鳳，王家福，康 斌，李建林，尹忠良

（杭州佑本動物疫苗有限公司，浙江杭州310018）

1 豬偽狂犬病概述

偽狂犬病最早于1813年發生于某牛群，病牛極度瘙癢，癥狀與狂犬病相似，因此稱為“偽狂犬病”。20 世紀70年代后，養殖產業開始密集，再加上國際貿易引起動物及副產品運輸量增加的影響，偽狂犬病由牛傳染給豬[1]。偽狂犬病病原為PRV，屬皰疹病毒科甲皰疹病毒亞科，其毒力由多個基因協同控制，主要有編碼胸苷激酶（TK）、糖蛋白gE、gD、gI 和核苷酸還原酶（RR）等，其中TK 是PRV的主要毒力基因。TK基因的失活大大地降低病毒毒力而不影響病毒在組織培養中的增殖，該基因對病毒在中樞神經系統中的復制起主要作用，而且通過基因工程手段完全缺失TK基因的疫苗毒株在臨床應用中不會出現毒力返強現象。gE糖蛋白為豬偽狂犬病病毒的非必需蛋白，決定其毒力，并促進其進入中樞神經系統。gE基因的缺失可降低病毒毒力及神經組織嗜性，從而進一步提高疫苗的安全性。gG 蛋白是一種趨化因子結合蛋白，通過結合趨化因子使其不能發揮功能，導致機體不易或難以識別入侵的病毒，缺失gG基因可以迅速繼發細胞免疫，產生大量的α和β干擾素[1-2]。

PRV 宿主范圍廣、復制周期短、高度致病性。徐志文等[3]構建的SA215 重組病毒可在Vero、BHK21、IBRS、PK15、MDBK 和CEF 細胞上增殖并產生細胞病變。陳陸等[4]將SA215 接種Vero 細胞后8 h 細胞即變圓變亮，集聚成團，24 h 約有50%細胞形成空斑，40 h 時蝕斑面積可達90%。Wang 等[5]將構建的缺失gE 基因的HN1201 株接種PK15 細胞做蝕斑純化，疫苗滅活前抗原含量達108.67TCID50/mL。豬是PRV 的主要宿主和貯存宿主，一旦感染將終生帶毒。2 周齡以內仔豬感染PRV 后100%死亡，成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可出現屢配不孕、產木乃伊胎、返情率高等；公豬患病則睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力。PRV 常在神經節形成潛伏感染。PRV 通過口鼻感染后，最初在上呼吸道的上皮細胞內發生復制，接著感染扁桃體和肺，病毒還可通過三叉神經和嗅神經末梢侵入中樞神經系統導致化膿性腦膜炎，當機體受到外界刺激時病毒被激活，向外界排毒并造成持續性感染，即使接種疫苗也無法保護攜帶PRV的豬，只能通過剔除潛伏感染豬才能實現豬偽狂犬的凈化[6]。

2 豬偽狂犬病疫苗的應用

2011年以前使用Bartha-K61 疫苗，我國豬偽狂犬病控制得很穩定。2011年末，很多接種過Bartha K-61 疫苗的豬場暴發豬偽狂犬病。2012年1月，山東有超過8 萬頭以上的豬發病，表現出豬偽狂病的臨床癥狀，患病率達50%，大多數豬在出現癥狀后第3 d開始死亡，懷孕70～90 d的母豬中有35%出現流產。在發病豬中分離的3 種PRV毒株gE 基因在138～140 和1472～1474 位點有2 個不連續插入[7]。An等[8]對6個省15個豬場的臨床樣本PCR均檢測到PRV 的gE 基因，序列分析顯示所有分離株屬于一個相對獨立的基因決定簇，也含2個氨基酸插入。在保護試驗中，Bartha-k61 疫苗接種豬對SC 經典PRV 的攻擊提供100%保護，但對PRV 流行毒HeN1 只有50%保護。Wang等[5]以2011年分離的PRV變異株HN201為研究對象，缺失gE基因制備滅活疫苗，免疫3周齡仔豬，免疫豬均存活，未表現出任何臨床癥狀，而不免疫對照組豬則表現出典型的PRV呼吸系統癥狀和神經癥狀。

2.1 PRV滅活疫苗使用現狀

2001年，陳煥春等[9]從湖北某豬場死亡新生仔豬腦及內臟中分離出PRV 分離株Ea 株，接種BHK-21 細胞培養制備抗原，研制成功我國第1 個全病毒油乳劑滅活疫苗。母豬多次定期免疫該疫苗后，血清PRV 中和抗體可達、1∶16～1∶32，乳汁的中和抗體可達1∶64～1∶128，仔豬哺乳后中和抗體可達1∶64[10]。另一種被批準的是gE基因缺失的HN1201-△gE株滅活疫苗。據其研發團隊介紹，該疫苗對經典株（閔A 株）和變異株（HN1201 株）的攻擊均可達100%保護，而Bartha-K61 免疫組對變異株的攻擊只有60%保護。

2.2 PRV活疫苗使用現狀

1961年，Bartha將分離的PRV野毒在雞胚成纖維細胞上連續傳代，獲得了Bartha K-61（也稱K-61）疫苗株。該疫苗株不僅缺失了主要毒力基因gE及能與其組成復合物的gI蛋白基因，還在US區存在其他一些缺失，是一種天然的基因缺失疫苗，確保了疫苗的安全性。1979年，哈爾濱獸醫研究所將Bartha-K61 種毒引入國內成功試制弱毒疫苗，有效遏制我國PR 疫情。吳文福等[11]測定該疫苗免疫豬后的抗體消長規律，發現豬免疫后第7 d 抗體水平開始上升，35 d達高峰，高水平的免疫抗體維持時間長達2個月以上，直至免疫后365 d PRV 中和抗體效價仍可達6.8，表現出優良的免疫效果。

2003年，四川農業大學郭萬柱教授團隊研制出我國第一個豬偽狂犬gE/gI/TK/LacZ+基因缺失活疫苗（SA215）。用SA215 株疫苗免疫母豬所產的所有仔豬均獲得高水平母源抗體，7 日齡平均效價高達28.56，隨著日齡增長抗體水平呈下降趨勢，到60日齡平均效價為22.56；70日齡商品豬接種后，經過近100 d育肥，其出欄率增加20.83%。陳陸等[4]將三基因缺失疫苗（SA215株）和Bartha-K61株進行免疫攻毒，第2 d起接種豬均出現發熱、精神沉郁、食欲下降，第5 d 恢復正常；而未接種對照組則在攻毒后第1 d 發熱、腹瀉，第4～5 d死亡，攻毒后SA215比Bartha接種豬的增重受阻天數、發熱期及散毒期均縮短。

豬偽狂犬活疫苗TK/gG/gE 三基因缺失疫苗株（HB-98株）是以Ea株為背景，應用分子生物學技術改造篩選的活疫苗毒株[2]。何啟蓋等[12]以105.0TCID50的PRV HB-98株接種新生仔豬，接種后連同對照組用鄂A 強毒攻擊，試驗豬未出現不良反應，而對照豬全部發病，其中3/4的仔豬死亡。受現實低溫冷凍條件制約，疫苗的研發又延伸了1個新方向，2016年，豬偽狂犬病TK/gE/gI 三基因的缺失株耐熱保護劑活疫苗（HB2000）獲批。

實際養殖生產中不乏免疫失敗的現象發生，其中1 個非常主要的因素是免疫方式。仔豬最好要采用噴鼻免疫，噴鼻免疫屬于黏膜免疫，霧狀疫苗在黏膜表面2 h 內可被機體吸收，保證機體吸收足量的抗原。吸收的抗原利用“提前占位”原則，提前進入三叉神經節，避免后期偽狂犬野毒的感染。

而針對近年來Bartha-K61 毒株疫苗對我國當前流行的PRV 強毒株保護不佳的問題，學者們開始著手PRV 流行毒疫苗的開發。

3 豬偽狂犬病疫苗發展趨勢

無論對活疫苗還是滅活疫苗，免疫佐劑均可以刺激機體產生非特異性免疫應答，增強疫苗的免疫效果。PRV疫苗以細胞免疫為主。Lin等[13]在Ea株滅活疫苗中加入重組豬IL2，可顯著提高免疫豬的中和抗體水平和CTL活性，對Ea 株強毒的攻擊產生很好的免疫保護。Rooij 等[14]以BarthaK-61疫苗為基礎制備PRV弱毒活疫苗和滅活疫苗，兩次免疫SPF 豬并于二免后接種105PFU 的NIA3 野毒，接種BarthaK-61 活疫苗+佐劑組和BarthaK-61 活疫苗組的豬產生了高水平中和抗體及明顯的淋巴細胞增殖反應（LPT），尤其是BarthaK-61活疫苗加佐劑組的LPT反應最強。相比之下，接種Bartha K-61 滅活疫苗的兩組試驗豬只產生了低水平的中和抗體和極弱的LPT反應，兩個滅活疫苗組盡管抗體水平有顯著差異，但兩組免疫保護效果均較差。表明免疫保護與LPT反應強度有關，與中和抗體滴度之間缺乏相關性。

PRV 基因組龐大，具有眾多非必需基因和非編碼區，PRV還具有很好的免疫原性且易感動物廣泛，適合作為載體表達外源基因開發多種動物疫病的多聯疫苗。徐志文等[15]以PRV SA215株為載體插入HCV 的E2基因，構建重組病毒SA215（A），仔豬免后28、42 d 分別進行PRV（Fa 強毒，106PFU）和HCV（豬瘟石門系血毒1ml，105MLD）攻毒。結果重組病毒SA215（A）對于偽狂犬病與SA215活疫苗相當，對于豬瘟則介于豬瘟兔化弱毒疫苗和豬瘟睪丸細胞苗之間，顯示出較好的免疫效果。Lei 等[16]以PRV 變異株為骨架，缺失gE/gI/TK基因后也插入CSFV的E2基因構建重組病毒，以PRV（TJ株）、豬瘟石門系攻毒，免疫豬未表現出任何臨床癥狀且產生了針對PRV和CSFV的中和抗體，表明構建的重組病毒可完全抵抗PRV和CSFV強毒的攻擊。徐高原等[17]構建了表達乙型腦炎病毒NS1 基因的重組偽狂犬病病毒株TK-／gG-／NS1+，經檢測重組病毒能表達具有生物活性的NS1蛋白，免疫仔豬能產生乙型腦炎病毒特異性抗體及CTL 活性。目前，關于PRV 病毒載體的重組疫苗均處于實驗室研究階段，希望將來能有所突破，開發出安全性好，免疫原性強的重組疫苗，達到PR根除的最終目標。

4 結論

文章對當前我國豬偽狂犬病的流行現狀進行了論述。在當前非洲豬瘟背景下，針對安全性更高，采用豬偽狂犬病流行毒株制備的商品化滅活疫苗對變異株進行保護是比較妥當的選擇。鑒于PRV 作為基因表達載體的有利條件，研發以PRV為載體的多聯疫苗具有很好的發展前景。