碳對微生物–根系介導的蔬菜作物磷吸收的影響

李洪亮，諸海燾，徐四新，蔡樹美，付子軾，張德閃

（上海市農業科學院生態環境保護研究所/農業農村部上海農業環境與耕地保育科學觀測實驗站/上海市設施園藝技術重點實驗室, 上海 201403）

在集約化農業生產中，經常施用大量的磷肥以滿足作物生長，實現產量的增加[1]。然而施入的大部分磷肥會被土壤固定，成為作物難以利用的無效態磷[2]。微生物是土壤磷循環的重要驅動因子，微生物磷周轉在調節磷有效性方面起著重要的作用[3]。土壤磷有效性的變化會誘導植物調節根系形態與根際分泌物的釋放，以形成高效的磷吸收策略[4]。例如，當土壤有效磷含量降低時，植物通過增加總根長，降低根系直徑(增加比根長)，提高根系對土壤有效磷的吸收[5–6]，或者通過增強酸性磷酸酶和有機酸(如檸檬酸和蘋果酸)的分泌，活化土壤難溶性有機磷和無機磷，提高土壤磷有效性[4,7–8]。然而，有關作物如何調節根系形態和根際分泌物響應微生物介導的磷周轉尚不明確。

增添有機碳源可以為土壤微生物提供生長所需的能量，通過刺激微生物的增生/死亡，啟動微生物介導的磷周轉[9–10]。然而，微生物磷周轉對磷有效性的調節作用取決于土壤碳的有效性[11]。例如，添加碳源初期，供微生物生長繁殖的有效碳含量顯著提高，微生物快速生長，微生物對磷的吸收因此增加，導致土壤有效磷含量降低[12–13]，微生物與根系之間對磷的競爭加劇。隨著微生物呼吸作用對碳的耗竭，土壤中供微生物利用的有效碳含量逐漸下降，微生物因碳源缺乏而死亡并向土壤重新釋放磷資源，從而增加了植物可利用的有效磷含量[14]。微生物磷周轉誘導的土壤磷有效性的動態變化，可能會引起作物根系形態和根際分泌物的動態響應，影響作物磷吸收[15–16]。然而，外源有機碳源添加后有關微生物磷周轉對土壤磷有效性的影響，以及介導作物磷吸收的根系/根際屬性的研究仍然缺少系統的分析。研究微生物–根系互作的動態過程及其對作物磷吸收的影響，對于探索強化微生物磷周轉協同根系提高磷利用效率的根際調控措施至關重要。

磷肥的過量施用是集約化蔬菜種植體系磷肥管理中普遍存在的問題[17]。由于蔬菜根系小而淺，磷的利用效率低，大量的磷資源殘留在菜田土壤[17]，導致土壤碳/磷失衡，限制了微生物介導的磷周轉對磷的活化作用[18–19]。鑒于土壤有機碳源的供給能夠刺激微生物增生，影響微生物代謝活動。因此，我們假設向土壤添加有機碳源可以啟動微生物介導的磷周轉，調節土壤磷有效性，從而影響根系形態、根際分泌物以及作物地上部磷吸收。本研究以綠葉菜上海青作為研究對象，以葡萄糖作為有機碳源，利用盆栽模擬試驗，研究外源碳調控對微生物–根系互作過程及其介導的作物磷吸收的影響，探索強化微生物–根系互作，提高磷肥利用效率的根際管理措施，為集約化蔬菜種植體系磷肥的減施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與材料

試驗設置添加葡萄糖(+G)和不加葡萄糖(?G)兩個處理，每個處理8次重復，分兩次采樣，分析添加葡萄糖后土壤微生物量磷、有效磷(Olsen-P)、根系(根系生物量、根冠比、根長、直徑、比根長和根系組織密度)/根際屬性(磷酸酶、檸檬酸和蘋果酸)特征以及作物磷吸收的動態變化。供試土壤取自上海市農業科學院莊行實驗站稻田土壤(30°53′N,121°22′E)，土壤類型為潛育土，其基礎理化性質如下：容重 1.41 g/cm3、有機碳 16.7 g/kg、全氮 1.2 g/kg、全磷 0.7 g/kg、無機氮 37 mg/kg、有效磷 9 mg/kg、速效鉀 94 mg/kg、pH 為 6.8 (土水比 1∶5)。供試土壤風干過 2 mm 篩，每個塑料花盆 (長×寬×高 = 17 cm ×9 cm × 9 cm)裝 1.5 kg 的土壤。所有處理均不加外源磷，為保證作物正常生長，所有處理添加作物生長的其他必需養分，每盆土壤的供應量分別為：Ca(NO3)2·4H2O 250 mg、K2SO4267 mg、MgSO4·7H2O 87 mg、Fe-EDTA 11.7 mg、MnSO4·H2O 13.3 mg、ZnSO4·7H2O 20 mg、CuSO4·5H2O 4 mg、H3BO32.7 mg、Na2MoO4·5H2O 0.33 mg。將土壤和養分充分混勻，用稱重法按田間持水量的75%澆水，平衡3天后進行播種。

供試作物為上海青(油菜)，品種為夏青3號(Brassica chinensisL. Xiaqing3)，由上海市農業科學院園藝所提供。試驗開始前，將種子泡入10% H2O2(v/v)中浸泡20 min消毒，用去離子水反復沖洗干凈，隨后將種子浸泡在飽和CaSO4溶液中，在避光通氣條件下浸泡12 h；隨后將吸脹后的種子擺放在墊有濕潤濾紙的托盤上，在恒溫培養箱中23℃條件下避光催芽2天。每盆播4顆種子，待幼苗“兩葉一心”后間苗，留2棵長勢一致的幼苗。

本試驗于上海市農業科學院莊行實驗站的溫室大棚內進行。預試驗結果表明，葡萄糖的添加量為C 0.2 g/(kg·土)時，作物生長狀態正常。在上海青種植14天后，添加葡萄糖，葡萄糖的加入量為C 0.2 g/(kg·土)，按田間持水量的75%配置葡萄糖溶液，用注射器注入土壤。基于土壤微生物量C∶N平均值為8∶1，為避免微生物氮礦化所導致的土壤速效氮含量的變化對作物根系的影響[20-21]，在添加葡萄糖的同時按 N 25 mg/(kg·土)的比例添加 Ca(NO3)2·4H2O溶液，不加葡萄糖的處理加入等量的Ca(NO3)2·4H2O溶液。試驗期間溫室平均溫度維持在白天21℃～33℃，夜晚16℃～23℃。每天采用稱重法澆水，保持田間持水量的75%。

1.2 樣品采集與項目測定

上海青生長期為40天，在葡萄糖添加后的第7天(營養生長第21天)和第21天(營養生長第35天)分兩次采集植株、土壤、根系和根際樣品，此時作物處于快速的營養生長期。收獲時，沿著莖基部將植株地上部剪下，將剪下的植株地上部稱重，即為地上部鮮重。將根系從土壤中取出，輕輕抖動去掉松散的土體土壤，將黏附有根際土的根系置于裝有 50 mL 0.2 mmol/L CaCl2溶液中搖動 1 min得到根際土懸濁液[22]，吸取8 mL懸濁液至10 mL離心管，加入2滴微生物抑制劑避免微生物代謝對根際碳源物質的消耗，于?20℃下保存，用高效液相色譜法測定有機酸[23]。吸取2份0.5 mL的懸濁液至2 mL離心管中，加入0.1 mL對硝基苯磷酸二鈉，0.4 mL乙酸–乙酸鈉緩沖液和0.5 mL去離子水，其中一份加入0.5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，一份不加；30℃條件下培養30 min取出，向未加氫氧化鈉裝有樣品的離心管加入0.5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液終止反應，在405 nm波長下比色，計算植物根際酸性磷酸酶活性[24]。

采集兩份土壤樣品，過2 mm篩充分混勻，一份自然風干用于測定土壤有效磷含量，另一份于?20℃下保存，用于測定微生物量碳、磷含量。土壤微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸—K2SO4浸提法測定[25]：稱取相當于10 g烘干基重的新鮮土壤2份，其中1份用無乙醇氯仿避光熏蒸，另外一份不加氯仿作為對照按同樣方法培養，24 h 后用 0.5 mol/L K2SO4浸提(土水比為1∶4)，采用TOC-VCHP有機碳分析儀測定微生物量碳含量。微生物量碳計算公式為 MBC =EC/kC，其中，EC為熏蒸后的土壤碳含量與未熏蒸土壤碳含量的差值，kC為轉化系數0.45。土壤微生物量磷(MBP)采用氯仿熏蒸—NaHCO3浸提法測定[26]：稱取相當于4 g烘干基重的新鮮土壤9份，其中3份用無乙醇氯仿避光熏蒸，另外6份不加氯仿作為對照按同樣方法培養，24 h后氯仿熏蒸以及無氯仿培養的 3 份土壤用 0.5 mol/L NaHCO3直接浸提 (土水比為1∶20)，鉬藍法測定土壤有效磷含量，另外3份無氯仿培養的土壤樣品在用 0.5 mol/L NaHCO3浸提的同時加入 0.5 mL 含 P 250 μg/mL 的 KH2PO4溶液，鉬藍法測定土壤有效磷含量，計算外加正磷酸鹽態無機磷(Pi)的回收率。微生物量磷計算公式為MBP= EPi/(kP× RPi)，其中 EPi為熏蒸土壤 Pi與未熏蒸土壤 Pi含量的差值，RPi= (加 Pi的土壤提取的 Pi –未熏蒸土壤提取的 Pi)/ 25 × 100%，kP為轉換系數，取值0.4。Olsen法測定土壤有效磷含量[27]。

將地上部樣品放入烘箱105℃殺青30 min，然后65℃下烘干至恒重，測量地上部干重，粉碎，用濃硫酸–雙氧水法消煮，鉬黃顯色法測定消煮液磷濃度，計算地上部磷吸收量[植株地上部磷吸收量(mg/plant)=植株地上部干重(g/plant) × 植株地上部磷含量 (%) × 1000]。

將根系用清水沖洗干凈，用根系掃描儀(Epson Expression 1600 pro, Model EU-35, Tokyo, Japan)掃描全部根系，用WinRhizo軟件處理掃描圖像，計算總根長、根直徑和根體積，掃描完成后將根系65℃下烘干至恒重，測根系干重，計算根系比根長、組織密度和根冠比。

1.3 數據分析

用Studentt-test 檢驗法分析葡萄糖對上海青地上部鮮重、干重、磷吸收以及根系生物量和總根長的影響，同時分別分析葡萄糖和取樣時間對作物根系(根冠比、根系生長速率、平均直徑、比根長和根系組織密度)/根際屬性(酸性磷酸酶、檸檬酸和蘋果酸)以及土壤指標(微生物量碳、微生物量磷和Olsen-P)的影響。按以下公式，計算兩個取樣期內植株地上部、根系/根際屬性以及土壤相關指標對葡萄糖的響應比(RR)[28]：

式中：j′和j分別代表+G處理和–G處理中4個重復的其中一個樣本；Yj′和Yj為對應的樣本中植物地上部、根系和土壤指標的數值；n為Yj′?Yj的組合數，在本試驗中因為處理數為4，所以n為16。響應比為正說明葡萄糖的添加對該指標表現為促進效應，為負則說明添加葡萄糖對該指標為抑制效應，當添加葡萄糖的影響不顯著時，不進行響應比的計算。用Studentt-test檢驗法分析葡萄糖添加后第7天與第21天響應比的差異。使用Canoco 4.5軟件進行冗余分析(RDA)，分析土壤微生物量磷以及Olsen-P含量對上海青根系/根際屬性特征的影響。

2 結果與分析

2.1 添加葡萄糖對上海青地上部鮮重、干重和磷吸收的影響

葡萄糖添加第7天和第21天的上海青地上部鮮重、干重和磷吸收量在與不添加葡萄糖處理的差異不顯著(圖1)。

圖1 添加葡萄糖第7天和第21天上海青的地上部鮮重、干重和含磷量Fig. 1 Shoot fresh weight, dry weight and P content of Brassica chinensis at 7 and 21 days after glucose addition

2.2 添加葡萄糖對介導作物磷吸收的根系/根際屬性的影響

添加葡萄糖對上海青根系生物量、根冠比以及總根長有顯著的影響(圖2)。添加葡萄糖后第7天，上海青根系生物量、根冠比顯著增加，根系總根長降低；與不加葡萄糖處理(?G)相比，添加葡萄糖后上海青根系生物量增加了26%，總根長減少33%。從第7天到第21天，添加葡萄糖導致上海青根冠比增加。第21天，與不加葡萄糖的對照處理(?G)相比，添加葡萄糖促進根系生物量增加，根冠比提高，根系總根長增加31%。

圖2 添加葡萄糖對第7天和第21天上海青根系總根長、生物量和根冠比的影響Fig. 2 Total root length, root biomass and root/shoot ratio of Brassica chinensis at 7 and 21 days after glucose addition

如圖3所示，添加葡萄糖后上海青根系生長速率、根系平均直徑和比根長產生了顯著變化，對根系組織密度沒有顯著影響。與不加葡萄糖處理(?G)相比，添加葡萄糖(+G)后第7天上海青根系生長速率顯著降低了36%，根系平均直徑增加了27%，比根長降低了46%；第21天，添加葡萄糖促使根系生長速率增加了295% (P< 0.01)，根系平均直徑、比根長以及根系組織密度無顯著變化。

圖3 添加葡萄糖第7天和第21天上海青根系生長速率、平均直徑、比根長和組織密度Fig. 3 Root growth rate, average root diameter, specific root length and tissue density of Brassica chinensis at 7 and 21 days after glucose addition

如圖4所示，添加葡萄糖顯著影響了上海青根際酸性磷酸酶、檸檬酸的分泌，對蘋果酸的分泌沒有影響。添加葡萄糖后的第7天，根際酸性磷酸酶活性降低，根際檸檬酸的分泌與不加葡萄糖處理(?G)相比增加了106%。從第7天到第21天不加葡萄糖處理上海青根際酸性磷酸酶、檸檬酸的分泌增加，而添加葡萄糖處理上海青根際檸檬酸分泌降低。第21天，與不添加葡萄糖的對照處理(?G)相比，添加葡萄糖處理(+G)上海青根際酸性磷酸酶活性降低了52%，根際檸檬酸含量降低了71%。

圖4 添加葡萄糖第7天和第21天上海青根際土壤酸性磷酸酶活性以及檸檬酸和蘋果酸含量Fig. 4 Acid phosphatase activity, citrate and malate content in Brassica chinensis rhizosphere soil at 7 and 21 days after glucose addition

2.3 添加葡萄糖對土壤微生物量碳、微生物量磷和Olsen-P含量的影響

如圖5所示，添加葡萄糖顯著影響土壤微生物量碳、微生物量磷和土壤Olsen-P含量。在添加葡萄糖后第7天，添加葡萄糖刺激土壤微生物量碳和微生物量磷含量顯著增加，其中微生物量磷含量與不加葡萄糖處理(?G)相比增加了70%，土壤Olsen-P含量下降了35%。從第7天到第21天，對照土壤(?G)微生物量磷含量顯著增加而土壤Olsen-P含量降低；添加葡萄糖的土壤(+G)，微生物量磷含量降低，土壤Olsen-P含量增加。第21天，添加葡萄糖(+G)的土壤Olsen-P含量與不加葡萄糖處理(?G)相比增加了47%。

圖5 添加葡萄糖第7天和第21天根際土壤中的微生物量碳、微生物量磷和Olsen-P 含量Fig. 5 Microbial biomass C, microbial biomass P and Olsen-P content in Brassica chinensis rhizosphere soil at 7 and 21 days after glucose addition

2.4 上海青根系形態、根際分泌物特征和土壤磷有效性對葡萄糖的響應比

如圖6所示，上海青根系生物量對葡萄糖的響應比由添加葡萄糖后第7天的0.12增加至第21天的0.18，總根長從第7天的?0.19增加至第21天的0.14，根系生長速率由第7天的?0.22增加至第21天的0.5，比根長由第7天的?0.30增長至第21天的?0.03。然而，上海青根系平均直徑的響應比由0.1降低至0。從第7天至第21天，上海青根際土酸性磷酸酶活性和檸檬酸濃度的響應比顯著降低，其中根際酸性磷酸酶活性的響應比由?0.25降至?0.34，檸檬酸濃度的響應比由0.36降至?0.54。土壤微生物量碳的響應比在第7天和第21天無顯著變化，微生物量磷的響應比由第7天的0.27降低至第21天的0，Olsen-P的響應比則由第7天的?0.22增加至第21天的0.20。

圖6 添加葡萄糖后第7天和第21天上海青地上部生長特征、根系/根際與土壤特征對葡萄糖的響應Fig. 6 Crop growth, root/rhizosphere and soil traits of Brassica chinensis at 7 and 21 days after glucose addition

2.5 微生物介導磷周轉過程對植物地上部生長和根系功能屬性的影響

如圖7所示，冗余分析結果顯示了土壤微生物量磷以及土壤Olsen-P對上海青根系形態和根際分泌物的影響。冗余分析RDA1軸和RDA2軸分別解釋了61.5%和15.7%的根系形態和根際分泌物變化特征。微生物介導的磷周轉對上海青根系平均直徑、根系生長速率、比根長、根際檸檬酸和蘋果酸分泌有較強的影響。其中，土壤微生物量磷與根系生物量、根冠比、根系直徑、檸檬酸的分泌呈正相關；Olsen-P含量則與根系生長速率呈顯著正相關。

圖7 根際土壤微生物量磷和Olsen-P對根系功能屬性影響的冗余分析Fig. 7 Redundancy analysis (RDA) of the effects of rhizosphere soil microbial biomass P (MBP) and Olsen-P content on root indexes of Brassica chinensis

3 討論

與不加葡萄糖處理相比，添加葡萄糖后土壤微生物量磷在第7天增加而第21天降低，土壤Olsen-P則在第7天降低而第21天上升，該結果表明添加葡萄糖啟動了微生物介導的磷周轉，并驅動了土壤有效磷含量的動態變化(圖5～圖7)。添加葡萄糖后的第7天(作物生長的第21天)，土壤Olsen-P含量顯著下降(圖5～圖6), 這可能是因為葡萄糖為微生物提供足夠碳源，刺激微生物的快速增生，微生物為滿足自身生長需從土壤中快速吸收大量的磷，導致土壤可利用的有效磷(Olsen-P)含量下降[29]，植物根系與微生物之間對土壤磷的競爭加劇[3,30]。以往的研究表明土壤磷有效性的降低會誘導植物根系伸長，比根長增加，根際酸性磷酸酶活性增加，提高對土壤磷的吸收[4,31]。然而，本試驗發現添加葡萄糖后第7天上海青根系總根長降低，根系平均直徑增加，比根長降低，酸性磷酸酶活性降低(圖2～圖4)，這說明還存在其他環境因素直接或間接影響根系形態和根際分泌物的響應。例如，微生物增殖能夠直接改變根系生長調節劑(如生長素)的分泌[32]，可能導致根系變粗，伸長速率降低(圖2、圖3)；另外，在添加葡萄糖后的第7天，即作物生長的前21天，作物處于幼苗期，根系較小，競爭能力弱，植物根系為了適應微生物特別是有害微生物的快速增殖，會提高碳向地下根系的分配，增加粗根的生長，增強作物抵御有害微生物侵襲的能力[33–35]。作物通過協調根系形態和根際生理過程響應土壤環境的變化，以獲取最大的磷吸收[4]。例如，微生物增生刺激粗根的增生[33–35]，粗根的生長伴隨著有機酸或磷酸酶分泌的增強(圖4b)[4,15]，然而，微生物增生尤其是編碼堿性磷酸酶phoD基因的磷代謝微生物群落的增生，加劇了微生物與根系對有機磷的競爭[36]，這可能會誘導植物分泌大量的有機酸以躲避微生物對有機磷源的競爭[33]，進而提高對土壤難溶性無機磷的活化與利用[2,15]。粗根降低了根系的周轉速率，有助于根系有效的保持養分，避免由于根系組織脫落造成的磷損失，以維持作物生長發育的需要[37]。綜上所述，添加葡萄糖初期，微生物的大量繁殖導致土壤Olsen-P的顯著降低，上海青增加根際檸檬酸的分泌，活化并利用土壤難溶性無機磷，促進粗根的生長，降低根系周轉造成的磷損失[37]，進而提高磷的吸收與利用效率，維持地上部磷吸收和生物量累積(圖1、圖7)。

微生物磷周轉是由微生物增生與死亡驅動的動態過程，從而決定了土壤磷有效性的動態變化以及根系/根際分泌物的動態響應。隨著碳的耗竭，微生物因缺乏碳源死亡裂解[19]，而根系逐漸變大，競爭能力逐漸增強，同時微生物死亡并向土壤中釋放磷，促進土壤有效磷(Olsen-P)含量的增加(圖5)[35]。微生物死亡和土壤有效磷(Olsen-P)的提高意味著植物根系生長環境的改善，以及作物根系形態與根際生理過程的響應[38]。例如，從添加葡萄糖后第7天到第21天，添加葡萄糖處理上海青根系生長速率顯著高于未添加葡萄糖的處理，總根長增加(圖2)。另外，盡管第7天添加葡萄糖處理根系平均直徑顯著高于未添加葡萄糖的處理，但是在第21天，二者的差異縮小(圖3)，這表明在第7天到第21天的營養生長期上海青加快了細根的增生，以提高根系對有效磷的吸收[15]。因此，上海青通過降低根際酸性磷酸酶活性和檸檬酸的分泌，將資源供給根系的快速伸長(圖2c、圖3a)[4,39]。由此可知，添加葡萄糖刺激微生物量磷庫的增加，而隨著碳的耗竭，磷從死亡微生物轉移到土壤，促進土壤有效磷含量的提高，誘導作物根系的快速伸長(圖5、圖7)。

本研究通過根系碳驅動的微生物磷周轉與植物根系/根際特征的共變關系，闡明了微生物協同根系影響蔬菜作物(上海青)磷吸收的互作效應。雖然在本研究中，葡萄糖的添加對植物地上部磷吸收和生物量沒有顯著的影響，但是大量的研究表明外源有機碳的調控對作物磷吸收和產量有顯著的促進效應[40–43]。這可能是由于本試驗是在作物生長后的第14天添加的外源葡萄糖，微生物爆發對根系造成的直接傷害影響了碳驅動微生物磷周轉協同根系對作物磷吸收作用的發揮[34–35]。另外，添加葡萄糖后第21天便停止觀測，此時添加葡萄糖后的土壤有效磷含量仍然比未加葡萄糖的土壤高，土壤中植物可利用的有效磷資源未被充分吸收，微生物磷周轉對作物磷吸收的促進效應沒有得到充分發揮。為了明確微生物磷周轉及其對作物磷吸收的調控效應，我們需要通過進一步的研究來探索強化微生物磷周轉調控根系-微生物互作及其對作物磷利用的長期影響。盡管在本試驗條件下碳調控對蔬菜作物生長和磷吸收沒有顯著的影響，然而本研究證明碳驅動的微生物磷周轉與作物根系形態及根際分泌物的即時響應共同決定作物磷吸收。由此可見，碳驅動的微生物-根系互作過程是外源碳調控促進作物磷吸收效率的重要機制，通過外源碳調控強化微生物-根系互作增效作用是提高集約化蔬菜種植體系磷利用效率的有效措施。

4 結論

添加葡萄糖顯著增加了前期(添加葡萄糖后第7天)根際土壤中的微生物量碳和磷，降低了土壤有效磷含量，作物通過增加檸檬酸的分泌來滿足自身對磷的需求。后期(添加葡萄糖后第21天)微生物量磷的降低，促進了根際有效磷含量的增加，誘導根系的快速增生，改善作物的磷素營養。因此，碳通過驅動土壤微生物，從土壤磷有效性和作物根系磷吸收策略兩方面影響了作物的磷素營養。