檸檬酸桿菌對X70 管線鋼腐蝕行為的影響*

張 歌， 馬 璇， 羅 剛， 鄭 浩 編譯

（1. 陜西電子工業研究院， 西安 710065；2. 國家石油天然氣管材工程技術研究中心， 陜西 寶雞 721008；3. 寶雞石油鋼管有限責任公司， 陜西 寶雞 721008；4. 陜西航天時代導航設備有限公司， 陜西 寶雞 721006）

0 前 言

鋼質管道是世界范圍內廣泛使用的主要管道類型之一， 近50 年來已成為石油天然氣輸送的主干網。 然而， 由于其經常暴露在腐蝕環境中， 會降低使用壽命， 增加失效的風險。 工業上用于清潔的酸性溶液和細菌造成環境酸化是導致鋼管力學性能下降和結構早期失效的兩個主要原因。 因此， 特別是在酸性環境中使用時， 保護鋼管不受腐蝕至關重要。 添加緩蝕劑是最有效、 最實用的防腐蝕方法之一。 近年來， 人們對引入合適的有機物作為緩蝕劑進行了大量的研究， 并闡明了幾種可能的防腐機理。 但是， 特定緩蝕劑的使用效果取決于腐蝕環境和鋼管類型。

微生物腐蝕 （MIC） 是由工業和自然系統中的微生物 （細菌、 真菌和藻類） 引起的腐蝕。MIC 是生物污垢的后果之一， 但其腐蝕行為一直存在爭議， 包括代謝產物對管道的腐蝕加速和腐蝕抑制以及生物膜的形成。 生物膜是一種或多種微生物的集合體， 細胞在不使用某種黏附促進劑的情況下相互黏附。 這些貼壁細胞通常嵌入胞外多聚物 （EPS） 基質中， 并在較短的時間內附著在金屬表面。

硫酸鹽還原菌（SRB） 是造成金屬合金發生微生物腐蝕的主要菌種。 細菌的積累和生物膜的形成極大地影響了電化學過程。 生物膜的形態和結構對各SRB 菌株的腐蝕行為有很大影響， 有研究者發現致密的生物膜能夠保護金屬表面， 也有研究者發現表面形成穩定的生物膜加快了腐蝕的動力學過程。 當微生物在金屬基材上變得負活性時， 可以通過幾種方式加速厭氧MIC 行為，如陰極去極化， 硫化鐵薄膜與金屬基材形成耦合電偶， 金屬離子與生物膜中EPS 發生螯合， 從而加速腐蝕。

微合金化管線鋼因其優越的性能在石油天然氣管網中得到了廣泛應用， 在管線鋼服役過程中最大的威脅之一就是發生MIC， MIC 主要受管線鋼成分、 組織、 土壤環境等因素影響， 而微生物會直接影響土壤環境。 雖然在管道上涂敷外防腐層起到了保護作用， 但隨著服役時間的延長， 服役條件可能會發生變化， 或者由于殘余應力導致管道涂層剝離， 鋼管就會直接暴露在土壤中接觸到細菌發生腐蝕。

X70 管線鋼在石油天然氣輸送中具有重要的作用， 但硫酸鹽還原菌對其腐蝕行為的具體機理尚未得到詳細的研究。 因此， 筆者重點研究了X70 管線鋼在硫酸鹽還原檸檬酸桿菌的土壤模擬溶液中的腐蝕行為， 本研究中使用的細菌菌群是從含污泥的土樣中培養的， 采用開路電位（OCP） 和電化學阻抗譜 （EIS） 等電化學方法，在厭氧條件下對金屬表面的生物膜及其他腐蝕產物進行了表征， 并利用場發射掃描電鏡 （FESEM） 研究了金屬表面生物膜及其他腐蝕產物的形貌和化學成分。

1 試驗材料與方法

1.1 樣品制備

在X70 管線鋼板上取15 mm×15 mm×10 mm試樣， 其化學成分見表1， 金相顯微組織如圖1所示。

表1 X70 管線鋼化學成分 %

圖1 X70 管線鋼的金相顯微組織

通過圖1 可以看出， X70 管線鋼金相組織主要由塊狀鐵素體和細小珠光體組成。 將試樣鑲嵌在環氧樹脂上， 留下225 mm2的裸露面積。 先將樣品進行研磨和拋光， 然后用蒸餾水清洗， 接著用95%乙醇沖洗并在丙酮中脫脂后， 將樣品通過紫外線燈滅菌15 min。

1.2 微生物培養基制備

本研究中使用的土壤來自伊朗阿瓦士（Ahvaz），通過在厭氧條件下制備模擬土壤培養基。 將無菌試樣分別置于細菌培養基（生物系統） 和無菌培養基（非生物系統） 中， 以進行腐蝕試驗。

1.3 菌株鑒定

菌株鑒定通過16S rRNA 測序。 采用煮沸法從指數生長期的活性細菌菌落中提取DNA。 用正向 （fD1： 50-CCGAATTCGTCGACAACAGAGT TTGATCCTGCTCAG-30） 和反向 （rD1： 50-CCC GGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-30）引物PCR 擴增16S rRNA 基因。 通過在瓊脂糖凝膠上電泳確認PCR 產物， 然后測序。 使用BLAST 算法將獲得的序列與GenBank 數據庫中的可用序列進行比較。 由于光密度 （OD） 與培養基中的活菌數和生物膜的形成有線性關系， 因此， 采用UV-M51 分光光度計計算OD 隨時間的變化。 另一方面， 采用碘量滴定法測試純化菌株的硫酸鹽還原量和土壤模擬液中硫化物濃度隨時間的變化。

1.4 表面形貌及顯微分析

從生物（有菌） 和非生物（無菌） 系統中取出試樣， 每次試驗后對腐蝕產物進行表面形貌觀察和顯微分析， 采用場發射掃描電子顯微鏡（FESEM） 和能譜儀 （EDS） 分析表面產物的形貌和元素分布， 并通過掃描電鏡（SEM） 對腐蝕坑形貌進行觀察。

1.5 電化學測試

采用開路電位（OCP） 和電化學阻抗譜（EIS）研究不同時間間隔（7 天、 14 天、 21 天、 28 天、40 天） 生物和非生物系統中模擬土壤溶液中腐蝕的電化學性能。 電化學測試在（23±2） ℃下進行，利用ZView 軟件對測得的EIS 數據進行擬合。

2 結果和討論

2.1 菌株鑒定

圖2 所示為純化菌株在模擬土壤溶液中OD（波長600 nm 處） 隨時間的變化曲線。 圖2 表明菌株的生長過程可分為三個階段： ①第3 天～第21 天是第一階段（指數階段）， 此階段活性菌數量迅速增加， 第21 天細菌數量達到最大值。21 日齡細菌培養離心提取DNA， 對分離物16S rRNA 基因序列的分析表明， 與弗氏檸檬酸桿菌（相似性100%） 和巴拉克檸檬酸桿菌 （相似性99%） 的相似度最高。 ②21 天后 （死亡階段），活性菌數量迅速下降。 ③24 天后 （靜止階段），活性菌幾乎消失。

圖2 檸檬酸桿菌在40 天內的OD 曲線

圖3 所示為檸檬酸桿菌在生物和非生物系統中不同時間內產生的硫化物量。在非生物系統中， 硫化物濃度基本保持相對穩定， 從最初的60 mg/L 到40 d 后40 mg/L。該硫化物可能是由于土壤模擬液中的硫酸鹽化合物隨時間溶解所致， 因此溶液中的硫化物含量減少。

圖3 生物和非生物系統中硫化物濃度隨時間的變化曲線

由于硫化物的溶解濃度與第1 階段（指數階段） 的活性細菌數量直接相關， 因此推斷該階段細菌活性及代謝產物水平較高， 與OD 曲線完全一致 （圖2）。 當產生的硫化物量為471.4 mg/L時， 其值足以使一株檸檬酸桿菌作為硫酸鹽還原菌； 在細菌快速生長到第2 階段 （死亡階段），硫化物濃度明顯下降； 第3 階段 （靜止階段），OD 值和硫化物濃度值變化趨勢相似， 說明活性菌幾乎消失。

圖4 所示為生物和非生物系統中pH 值隨時間的變化情況。 由圖4 可以看出， 細菌的攻擊性因子和活性代謝產物改變了pH 值。 在生物系統中， pH 值從第1 天到第21 天急劇下降， 21 天后隨著時間的延長又逐漸升高。 在非生物系統中， pH 值基本保持在6.94 左右。

圖4 生物和非生物系統中pH 值隨時間的變化曲線

2.2 表面形貌及顯微分析

圖5 和圖6 所示為非生物系統中試樣在不同腐蝕時間的腐蝕產物形貌和EDS 圖譜。 由圖5 和圖6 可以看出， 腐蝕時間為7 天時， 金屬表面可見顆粒狀沉積物， 分布較為松散； 在14 天后， 金屬表面出現了更多的螺紋狀腐蝕產物和其他沉積物； 當達到21 天時， 在金屬表面形成具有多孔形貌的厚膜， 對腐蝕產物進行EDS 分析發現以鐵氧化合物為主， 還包括少量的氯化鈉、 碳基化合物和硫化物； 當腐蝕時間達到40 天時， 腐蝕產物開始變得疏松，無附著力， 隨著腐蝕時間的延長， 腐蝕產物逐漸流失， 因此出現了臺階， 一般認為， 這是由于Cl-在金屬表面富集， 破壞了表面膜層的穩定造成的。

圖5 X70 管線鋼在非生物系統中不同時間的腐蝕產物形貌

圖6 X70 管線鋼在非生物系統中不同時間腐蝕產物的EDS 圖譜

圖7 和圖8 為生物系統中試樣在不同腐蝕時間的腐蝕產物形貌和EDS 圖譜。 由圖7 和圖8可以看出， 腐蝕7 天時， 試樣表面分布著多個細菌、 小尺寸的菌落以及少許腐蝕產物， 細菌形態呈桿狀， 部分細菌相互連接在一起， 形成長條狀結構， 是SRB 的一般形態； 隨著腐蝕時間的延長， 吸附在金屬表面的細菌逐漸增多， 產生大量的EPS， 這些EPS 迅速粘附在金屬表面上， 14 天后呈現出多孔的生物膜形態； 21 天后生物膜外表面可見附著的細胞形貌。 圖7 （c）中主要有兩個區域， 即光外區 （A） 和暗內區（B）， A 區在形態上表現為密集排列的薄膜，分布不均， 對該區域進行EDS 分析發現， 腐蝕產物主要由硫化物、 碳基化合物、 鐵氧化物和少量的氯化鈉組成； 與A 區相比， B 區的硫化物含量較低， 對B 區進行EDS 分析發現， 腐蝕產物主要由鐵氧化物、 少量碳基化合物和氯化鈉為主， 但生物系統中兩個區域 （A&B） 的硫化物含量均顯著高于非生物系統中的硫化物含量， 這是由細菌代謝造成的。

圖7 X70 管線鋼在生物系統中不同時間的腐蝕產物形貌

圖8 X70 管線鋼在生物系統中不同時間腐蝕產物的EDS 圖譜

根據陰極去極化理論， 硫酸鹽還原菌可能通過將介質中的硫酸鹽還原為硫化氫， 通過氫化酶消耗陰極氫， 促進不同類型硫化鐵在試樣表面的形成。

圖9 所示為去除生物膜后， 試樣在非生物系統和生物系統中40 d 的腐蝕形貌。 在圖9 （a）所示非生物系統中， 試樣表面比較光滑， 表面只能觀察到幾個較淺的凹坑。 小凹坑可能是由于溶液中Cl-等一些腐蝕性離子通過生物膜孔隙滲透到電極表面而形成的。 隨后活性腐蝕物種與材料發生化學反應， 產生一些應力集中點， 從而形成腐蝕坑。 在圖9 （b） 所示生物系統中， 試樣上出現了幾個更深、 更大的凹坑， 表明本研究中使用的檸檬酸桿菌菌株可以增加鋼的局部點蝕。

圖9 X70 管線鋼去除生物膜后在系統中40 天的SEM 形貌

2.3 電化學測試

2.3.1 開路電位

圖10 所示為生物和非生物系統中EOCP隨時間的變化情況。 鋼在非生物系統中的EOCP在前21 天隨時間增加到-610 mV， 之后隨時間的增加而減小， 并在670 mV 左右保持恒定； 鋼在非生物系統中的EOCP在前21 天出現正移， 可能是由于溶液中非侵蝕性物種或化合物的積累、腐蝕產物的積累以及在鋼表面形成的保護膜，阻止了腐蝕性離子的滲透。 由此看來， 經過21 天后表面形成的相對致密的保護膜， 可以通過陽極極化作用最大程度地改變EOCP。 生物系統中EOCP隨時間 從-618 mV 上升到-570 mV， 然后穩定在-620 mV， 初始上升與活性菌數量及其代謝活性有關， 當細菌過程進入死亡期和穩定期 （21～40 天） 時， 電位降低， 證實有活性細菌存在時對EOCP的正效應。

圖10 生物和非生物系統的開路電位隨時間的變化曲線

2.3.2 電化學阻抗譜

圖11 所示為非生物系統中試樣的Nyquist圖、 Bode 相位角圖和Bode 模量圖隨時間的變化曲線。 采用Zview 軟件對EIS 譜進行擬合， 擬合參數匯總見表2 和表3。 由圖11 （a） 可以得出，電容半圓直徑所代表的阻抗大小在前21 天內增大， 之后逐漸減小， 也可以從圖11 （c） 得到驗證。 電容半圓直徑在前21 天增大是由于腐蝕產物在試樣表面的堆積和溶液中無機化合物的析出阻礙了腐蝕離子的滲透造成的。 21 天以后表面累積的腐蝕產物逐漸流失， 可造成電容半圓直徑的減小。 腐蝕產物中的氯化物和碳基化合物的存在在表面形成了粘附性較差的外層， 因而電荷轉移電阻減小， 腐蝕速率隨時間增加而增大。

表2 非生物系統中EIS 圖譜擬合結果對比

表3 生物系統中EIS 圖譜擬合結果對比

圖11 非生物系統中Nyquist 圖、Bode 相位角圖及Bode 模量圖

由表2 可知， 腐蝕時間從7 天增至21 天， 非生物系統中Rh值從330 Ω·cm2增加到356 Ω·cm2，Rct值從420 Ω·cm2增加到470 Ω·cm2。 研究認為，腐蝕時間的增加導致腐蝕速率的降低。 在這個時間段內， nh值從0.68 增加到0.79。 可見， 腐蝕產物層的形成起到了保護屏障的作用進而影響了溶解速率。 第21～40 天， Rct從470 Ω·cm2下降到361 Ω·cm2， Rct隨時間減小可能是由于不穩定膜的形成和腐蝕產物在電極表面的逐漸流失造成。

圖12 所示為生物系統中試樣的Nyquist 圖、Bode 相位角圖和Bode 模量圖。 當試樣處于生物系統中時， EIS 圖隨時間變化較明顯 （圖12 （a））。以半圓直徑為代表的阻抗幅值在前21 天急劇減小， 之后從21 天增大到28 天， 最后隨著時間的延長而減小（圖12 （b））。 Bode 模量圖中0.01 Hz值隨時間的變化趨勢也相似（圖12 （c））。

圖12 生物系統中Nyquist、Bode 相位角、Bode 模量隨時間的變化曲線

阻抗曲線直徑的初始減小與微生物代謝活動的最大值出現在指數階段相吻合， 說明檸檬酸桿菌菌株加速了電極表面的腐蝕過程。 在此期間，硫酸鹽還原菌通過新陳代謝將硫酸鹽還原為硫化物離子或還原為H2S， 形成半導電的硫化鐵膜， 并形成附著多孔的生物膜層， 從而促進腐蝕過程。

在圖13 中比較了由極化電阻Rp定義的表面膜的電荷轉移電阻和多孔電阻 （Rct、 Rh） 在非生物系統和生物系統中的線性求和值， 為研究腐蝕環境的影響提供參考。 在非生物系統中，管線鋼的Rp值在21 天時略有上升， 到40 天時則略有下降。 如前所述， 最初Rp的上升可以歸因于底層母材上形成了一層保護膜， 隨后的下降是由于保護膜出現了的惡化。 然而， 在生物系統中， Rp值在前21 天突然下降， 21 天后達到最小值68 Ω·cm2。 之后， 到28 天時迅速增加， 然后再減少到過程結束。 Rp的首次下降是由于細菌、 腐蝕性代謝物、 pH 的改變（圖4）、 胞外聚合物的產生以及表面多孔疏松的生物膜層的生長共同造成的。 此外， 表面形成導電的硫化鐵膜， 在硫化鐵與金屬之間發生電偶耦合， 增強了腐蝕動力學過程， 即在生物膜與游離金屬之間形成大陰極、 小陽極的腐蝕微電池， 惡化了腐蝕性環境， 加速了陽極溶解反應。

圖13 X70 管線鋼在生物和非生物系統中極化電阻（Rp） 隨時間的變化曲線

3 結 論

（1） 檸檬酸桿菌菌株在土壤模擬液中的生長過程可分為指數期、 死亡期和穩定期3 個階段。

（2） 生物系統中檸檬酸桿菌產生的硫化物量在第21 天 （指數階段） 迅速從100 mg/L 上升到600 mg/L， 表明該階段微生物代謝活動水平較高； 同時， 在生物系統中的鋼試樣表面極化電阻Rp由1 150 Ω·cm2降低到68 Ω·cm2。

（3） 非生物系統中的試樣， 由于在金屬表面形成了一層腐蝕產物保護層， 其Rp隨時間呈上升趨勢。

（4） 與非生物系統中的試樣相比， 生物系統中的底層金屬上觀察到更深的腐蝕坑， 表明在檸檬酸桿菌的存在下， 發生點蝕的傾向更高。