分子標記技術在水稻品種改良中的應用

張金霞 劉賀梅 孫建權 殷春淵 王和樂 胡秀明 田芳慧 王書玉

（河南省新鄉市農業科學院，新鄉 453002）

水稻是人類的主要食物來源之一，全球有20億以上人口以稻米為主食，水稻在我國的種植面積和產量均居各種作物之首。據國家統計局公報顯示，2019年我國水稻種植面積達2969萬hm2，總產量2.1億t，水稻育種技術的創新顯著提升了我國在水稻育種領域的國際地位，稻米品質和產量得到極大地提高。我國既是稻谷生產大國，也是稻米消費大國，稻米及其制品在日常生活中占有重要地位。目前，我國仍面臨糧食生產剛性需求與耕地、水資源短缺的矛盾，供給結構性矛盾，農業生產成本高與經濟效益低等矛盾；因此，不斷提高水稻產量和品質仍是育種的主要任務。近些年來，我國的水稻育種工作取得較大進展，從最初的矮化育種，經歷了三系到兩系的雜種優勢利用、超級稻的培育及目前的綠色優質超級稻，育種技術也從常規育種發展到綜合運用常規育種和現代分子育種技術。在品種選育過程中更加注重產量、品質、抗性、適應性等要素的綜合協調。

分子標記輔助選擇育種（MAS）從DNA水平上直接鑒定基因型，通過與目標性狀基因型緊密連鎖的分子標記，進行目標基因的篩選。在苗期或者低世代就可直接對目標基因進行檢測，幾乎不受環境條件的影響，無需再進行測交和自交檢驗，顯著提高了準確性和選擇效率。隨著更多水稻高產、優質、抗病蟲等基因被克隆，分子標記輔助選擇育種將在遺傳改良方面發揮重要作用。

1 分子標記技術

分子標記技術通過檢測與目標基因存在緊密連鎖標記的帶型，篩選含有目標基因的個體，與常規育種技術相比具有準確性高、周期短、目的性強等優點。常用的SSR標記數量豐富，均勻分布于整個基因組中，在品種間具有廣泛的位點變異，且具有共顯性，可同時鑒別雜合子和純合子。隨著測序技術的飛速發展，測序成本大幅度降低，水稻全序列的測定和EST數據庫的開發為SNP標記的開發和應用提供了條件。基因芯片是檢測SNP的重要手段，利用DNA芯片技術，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒光標記樣品進行大量分子雜交，可比較不同組織或器官的基因表達水平，篩選突變基因，分析基因表達模式。目前，水稻高密度基因芯片技術通過檢測樣品中目標基因的SNP變異位點，可快速準確檢測水稻重要的功能基因，從而發掘優良性狀，了解品種特性，加快育種研究進程。

2 分子標記的應用

2.1 分子標記在水稻抗病蟲育種中的應用

2.1.1 抗稻瘟病稻瘟病是由稻瘟病菌（Pyricularia oryzaeCav.）引起的在水稻全生育期都會發生的真菌性病害，其中，穗頸瘟和葉瘟影響較重。在水稻品種審定時，稻瘟病抗性是一項重要的評價指標，多數地區要求稻瘟病抗性綜合指數達到中抗以上。目前已有110多個稻瘟病抗性基因、500多個QTLs被鑒定[1]，分布于水稻12條染色體上的不同位點，且已被克隆的稻瘟病抗性基因至少有26個，其中Pi9、Pigm、Pi7、pi21、Pi50、Pi57和Ptr等為廣譜抗性基因[2]。已克隆的稻瘟病抗性基因相關分子標記陸續被開發并應用于水稻抗性育種中。

抗稻瘟病常規育種方法是將抗病基因通過雜交轉入目標株系，或將多個具有廣譜抗性的稻瘟病基因聚合到一個株系上，進而培育持久抗病品種。單基因的抗病性會隨著病原菌生理小種的變化逐漸喪失，采取聚合育種的方法可將多個抗稻瘟病基因導入同一品種中，同時抵抗多種生理小種的侵害，從而提高品種的廣譜抗性。張羽等[3]在研究稻瘟病抗性基因數目與水稻抗病性的關系時發現，品種的抗病性隨著水稻抗性基因位點數目的增多也相應提高，多個抗性基因共同作用可以有效提高水稻對稻瘟病的抗性。近幾年來，根據稻瘟病抗性基因所在區域的序列變異開發了多種分子標記，如Pita，Pi9（與Piz-t、Pi2、Piz-5、Pi50、Piz、Pigm、Pizh位點相同），Pik，Pi-kh（與Pi54、Pi54rh位點相同），Pi5（與PiCO39、RGA5、Os11gRGA位 點相同），Pia（與RGA4、Os11gRGA4位點相同），Pi-d2（與Pid2位點相同），Pid3（與Pi25位點相同）[4]。

王曉玲等[5]利用11個抗瘟基因的標記，對28份骨干粳稻和54份骨干秈稻進行抗性分析，明確了這些材料攜帶的抗稻瘟病基因種類及分布，為廣譜持久抗性秈粳材料創制及骨干親本的選擇與配組提供了參考。鄭祥正[6]開發了一種基于PCR技術的Pik基因座的InDel標記，該標記能準確地將Pik上功能基因與其他非抗病基因座區分開來，為篩選水稻抗稻瘟病種質資源提供了一種簡便有效的方法。趙國超等[7]利用Wx基因第四外顯子+693處突變建立檢測軟米特性的CAPS（NlaIII）分子標記，以及利用4種抗稻瘟病基因Pi9、Pita、Pib、Pigm分子標記培育出含有這4種稻瘟病抗性基因及軟米基因（Wxmq），同時還表現出高柱頭外露率的兩系不育系水稻新品系2179S，為培育具有稻瘟病抗性的兩系雜交稻提供了優良的不育系親本。馬作斌等[8]以攜帶抗稻瘟病基因Pib的遼粳9234和攜帶抗稻瘟病基因Pita的鐵粳7號為親本，從后代中鑒定到聚合抗稻瘟病基因Pita和Pib的新品種鐵粳16，該品種較其親本抗譜寬、綜合抗性更強。李友發等[9]將花藥培養選育出的晚粳類型不育系TS849與攜帶稻瘟病抗性基因Pigm的遲熟中粳水稻品種1350雜交，利用花藥培養創制一批加倍單倍體，通過分子標記選擇攜帶Pigm基因的不育系，成功選育抗稻瘟病的晚粳類型光溫敏不育系JF35-2，其稻瘟病抗性水平達到高抗級別，可作為抗原應用于抗稻瘟病雜交晚粳育種中。郭震華等[10]通過高分辨熔解曲線（HRM，high-resolution melting curve）技術，利用Pita及pik的HRM功能型分子標記Pita-G/T、Pik2-C/T，對67份黑龍江省主栽品種及優異種質資源進行基因分型，明確了Pita及pik在黑龍江省的分布情況，為抗稻瘟病育種提供了理論基礎。李虎等[11]利用香味基因Badh2-E7和廣譜抗稻瘟病基因Pi5、Pita、Pi2的功能標記對分離世代單株材料進行檢測，育成含Pi5、Pita、Pi2的優質香稻新品種桂香99，滿足了市場對抗稻瘟病優良食味稻米的需求。柳絮等[12]以帶有廣譜高抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的空育131為供體，以粳稻為遺傳背景的抗蟲轉基因（Cry1C）水稻新品系濟抗10號為受體，通過分子標記輔助選擇創制出了4個既抗蟲又抗稻瘟病的新材料SK01、SK02、SK03、SK04，為黃淮稻區抗病蟲水稻育種奠定了基礎。

2.1.2 抗白葉枯病水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌稻致病變種Xanthomonas oryzae引起的水稻重要病害。白葉枯病菌是革蘭氏陰性菌，通過水稻的水孔為害葉片，也可侵染葉鞘。病斑呈短條狀，多發生于中下部葉片的尖端和邊緣，隨著斑點的擴大，葉色變黃，擴展后成長條斑，當病斑繼續蔓延，葉色逐漸由白轉灰。目前，科學家已鑒定了46個水稻白葉枯抗性基因，其中11個基因已被克隆，并以此開發了重要基因的功能標記，如Xa5、Xa10、Xa13、Xa21、Xa23和Xa27[13-18]。

牛付安等[19]利用水稻高密度基因芯片技術成功選育了聚合白葉枯病抗性基因Xa21和抗稻瘟病基因Pi2、Pita、Pib、Pi9、Pi54、Pikm、Pit的早熟、優質、高產、穩產、易于制種的雜交粳稻新品系申優28，對優質雜交粳稻的選育具有重要的參考意義。湯劍豪等[20]利用回交和分子標記輔助選擇，將供體親本MD12086-1351中的抗白葉枯病基因Xa23，抗稻瘟病基因Pi9和抗褐飛虱基因Bph14、Bph15滲入到優質兩系雜交稻恢復系香5背景中，育成了3個同時攜帶Xa23、Pi9、Bph14、Bph15基因的新株系，是聚合育種典型的成功范例。陳志偉等[21]通過分子標記輔助選擇和系譜法相結合，選育出同時帶有抗白葉枯病基因Xa21、Xa23和抗稻瘟病基因Pi-2、Pi-1、Pi-kh的優良兩系不育系禾9S，該不育系的育性轉換起點溫度低（約23℃）、可繁性好、柱頭外露率高、米質優，目前利用禾9S已組配出禾兩優676等10多個雜交稻新品種，具有良好的推廣應用前景。

2.1.3 抗褐飛虱褐飛虱具有生長周期短、繁殖力強、易遷飛等生活習性，廣泛分布于亞洲各國的稻產區，主要通過刺吸危害，造成水稻減產或絕收。褐飛虱還通過傳播各種病毒，如叢矮病毒、齒葉矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒等，給水稻生產帶來嚴重損失。目前，已定位的抗褐飛虱基因有40多個，分布在第2、3、4、6、10、11和12染色體上，第4染色體上有16個抗性位點。其中，20個抗褐飛虱基因來源于栽培稻，24個抗性基因來源于7種野生稻。目前，已經被克隆的褐飛虱抗性基因有7個，分別為Bph3、Bphi008a、Bph14、BPH18、Bph26、BPH29、Bph32[22-28]。其中，Bph3來源于栽培稻Ptb33，對褐飛虱有廣譜抗性，已被成功克隆，該基因位點與分子標記RM586和RM588緊密連鎖。

馮銳等[29]利用與褐飛虱抗性基因緊密連鎖的SSR標記M4-10和INDEL標記M4-228，從BC1F1世代開始進行分子標記輔助選擇，獲得4個抗褐飛虱恢復系與3個不育系，其配制的12個雜交組合中11個組合的抗性均達中抗及以上水平，為抗褐飛虱雜交稻育種提供了優良種質材料。李進波等[30]利用分子標記MRG4766、AP22、76-2和MS5檢測，培育出聚合抗褐飛虱基因Bph14、Bph15和抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的恢復系R650，對褐飛虱和稻瘟病的抗性均表現為抗。李孝瓊等[31]通過回交選育、分子標記輔助選擇和田間抗性鑒定相結合的方法，篩選獲得3份聚合了稻飛虱抗性基因Wbph9、Bph14、Bph15和稻瘟病抗性基因Pi1的水稻材料，為選育抗病蟲害水稻恢復系提供了種質資源。

2.2 分子標記在水稻農藝性狀改良中的應用水稻Hd3a基因編碼的成花素是調控水稻抽穗通路中的關鍵因子，在短日照下促進抽穗，長日照下延遲抽穗。Hd3a包含多個等位基因，其中，hd3aKasa的功能強于Hd3aNip。hd3aKasa是高光效基因型，一般攜帶hd3aKasa的水稻品種產量更高，但會導致水稻開花延遲。雜合態的Hd3aNip/Hd3aKasa則表現出產量高、抽穗延遲適中等特性，比兩種純合基因型更具育種利用價值。常遠等[32]利用擴增受阻突變系統（ARMS，amplification refractory mutation system）的原理，開發了包含4條引物的共顯性分子標記hd3afnp，鑒定Hd3a的單核苷酸多態性，hd3afnp與表型完全連鎖，1次PCR反應可以精確區分兩種純合基因型和雜合基因型，為水稻的高光效分子育種提供了一種高效的檢測方法。陳國鑫等[33]利用ARMS原理開發出包含4條引物的控制秈粳稻分蘗角度差異的主效基因TAC1的共顯性分子標記tac1fnp，鑒定TAC1的功能單核苷酸多態性。相比TAC1xian，發生在tac1geng的A/G突變影響了粳稻的株型。兩個等位基因分別屬于單株高光效基因型和整體高光效基因型，處于雜合狀態時可以互補。通過一次PCR反應可以簡便準確區分兩種等位基因的純合及雜合，有助于水稻的高光效分子標記輔助選擇育種。卿冬進等[34]根據窄粒雜交稻親本美B的GW8基因序列與寬粒親本GW8序列第二內含子的2個堿基缺失差異，結合五引物擴增受阻突變體系技術，開發GW8基因熒光分子標記PM-GW8。該標記能快速檢測水稻GW8基因是否存在2個堿基缺失，為利用分子標記輔助選擇改良水稻粒寬提供了高效可靠的基因分型技術。周雷等[35]通過分子標記對7個長粒粳稻品種的7個粒長基因GS3、LGY3、qGL3、GL7、SLG7、TGW6、GS9和3個粒寬基因GS5、GW8、GW5進行了基因型分析，該結果對優質粳稻品種粒型基因型提供了較全面的信息，為分子標記輔助選育優質長粒粳稻新品種和親本組配提供重要的基因型參考。伍豪等[36]根據短粒雜交稻親本美B與長粒親本宜香B在GS3基因序列的差異，開發GS3基因的功能分子標記M-GS3，該標記能有效檢測出水稻親本及育種群體中的GS3長粒等位基因，從而為水稻粒長和千粒重的改良提供了便捷的檢測方法。王復標等[37]利用60對分布于水稻12條染色體組的SSR標記對190份水稻材料進行遺傳多樣性分析與群體遺傳結構分析，鑒定出8個與穗長、一次枝梗數、一次枝梗穗粒數、二次枝梗數、二次枝梗穗粒數、總穗粒數和飽滿穗粒數等性狀相關聯的標記，對表型變異的解釋率在0.0378～0.0648，這8個與農藝性狀相關的分子標記可以應用于高產水稻品種的選育過程中。

2.3 分子標記在水稻品質改良中的應用水稻香味是稻米品質的一項重要性狀，隨著人們生活水平的提高，香稻品種因其大米香味濃郁受到人們喜愛，并且種植香稻的經濟效益更高。水稻香味主要由位于第8號染色體上編碼甜菜堿脫氫酶的Badh2基因控制，該基因的缺失或插入突變導致功能的喪失，從而促使米香物質2-乙酰基-吡咯啉（2AP）的積累，使水稻表現為有香味。羅世友等[38]將香味基因Badh2導入贛晚秈30號中，利用分子標記Badh2-E7進行檢測，選育出含有香味基因Badh2的優質香稻品種九香粘，米質達國標優質3級。李榮田等[39]通過功能性SNP-fgr標記輔助選擇香味基因，同時利用34個雙親間具有多態性的SSR標記進行背景選擇，培育出除香味以外其他性狀與空育131相似或相同的早粳稻空育131（fgr）導入系。呂軍等[40]利用自主開發的香味基因fgr的功能標記與抗稻瘟病基因Pita的分子標記的基因聚合到一起，篩選到4個綜合性狀優良的抗稻瘟病香稻新品系遼粳香1-4號。胡蘭等[41]以香型軟米水稻松早香1號作為香味基因和軟米基因供體親本，以非香非軟長粒型水稻嘉禾218為轉育親本，利用香味基因和軟米基因的CAPS分子標記EheⅠ和Nla Ⅲ輔助選擇，成功選育出長粒香型軟米水稻品系上師大19號，該品系為上海地區推廣長粒香型軟米水稻奠定基礎。王康愷[42]采用3個SSR標記RM342、RM515、RM3600對后代進行基因型檢測，發現基因組合類型與γ-氨基丁酸含量之間呈極顯著相關。通過對γ-氨基丁酸含量與基因組合類型進行關聯分析，為利用分子標記輔助選擇篩選富含γ-氨基丁酸品系提供參考。

3 展望

隨著分子生物學和功能基因組的發展，水稻分子育種技術逐漸成為植物育種的重要輔助手段，通過連鎖標記進行基因型和表型篩選，實現將多個抗病蟲基因以及品質相關基因聚合到一個水稻品系中，形成性狀優良的多抗聚合品種，是未來分子標記輔助選擇的重點方向。

目前，分子標記多集中于質量性狀，尚未定位或連鎖不緊密的基因所控制的性狀以及數量性狀發展滯后、大量遺傳信息處于零散狀態以及育種群體達不到遺傳作圖的要求等問題制約著分子育種的發展。在未來，隨著生物技術不斷進步，分子育種將更加精準、高效，將轉基因以及基因編輯等技術與分子標記輔助選擇技術相結合，將會加快水稻育種的研究進程。