納米自組裝短肽RADA16在醫學中的應用研究與進展

高露瑤，敖弟書，宋鴻

(遵義醫科大學微生物學教研室，貴州 遵義 563006)

分子自組裝是生物體中普遍存在的一種現象，它不受外力影響便可自發聚集、組裝形成穩定結構。1993年Zhang等[1]在研究酵母Z-DNA結合蛋白Zuotin時發現了一種在水溶液中異乎尋常自組裝成納米纖維的短肽EAK16-Ⅱ，在此基礎上，相繼發現與合成許多納米自組裝短肽材料。自組裝短肽RADA16是利用“bottom-up”(自底向上)原理，采用自然界已有分子構件，通過分子與分子間的相互作用自組裝形成的一種新型生物材料。RADA16具有獨特的氨基酸序列(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)，在生理鹽溶液條件下可通過非共價鍵作用自發形成具有親水面和疏水面的β-折疊結構，最終自組裝形成含水量超過99%的納米纖維水凝膠[2]。相比于其他生物材料，RADA16不僅具有含水量高、生物相容性良好、可降解等優點，還可根據需要進行化學修飾，在醫學、生命科學領域具有良好的應用潛力[3-4]。據此，本文就納米自組裝短肽RADA16在細胞培養、藥物緩釋、再生醫學等方面的應用作一簡要綜述。

1 細胞培養

近年來，細胞三維(three dimensional, 3D)培養研究日益增多，培養技術日漸成熟。在既有的細胞3D培養方法中，利用載體(3D支架)進行細胞培養是最常用的一種培養方法。選用恰當的細胞支架，將為細胞的黏附、增殖、分化及細胞間相互作用提供更為適宜的空間微環境。

天然細胞外基質(extracellular matrix, ECM)主要由凝膠樣基質和纖維網架構成，為精密有序的網絡結構，而短肽RADA16在離子條件下可自組裝形成孔徑5～200 nm的納米纖維網格結構，其孔隙度與天然ECM相似[2]，同時其氨基酸序列設計中RAD(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)序列與細胞膜上整合素的配體結合位點RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)多肽序列相近，這就為細胞黏附生長提供了類似于天然ECM的3D培養環境，有利于細胞的黏附、增殖和分化[5-6]。而相比其他3D培養材料，如機械性能和細胞黏附性較差的藻酸鹽等有機材料復合物或動物來源的可能含有殘留生長因子甚至不確定成分的膠原、Matrigel等基質凝膠[7-8]，生物相容良好的納米自組裝短肽RADA16還具有成分純凈、無免疫原性等特點，這亦為細胞在支架中的生長提供了更為有利的生存條件。因此，RADA16是一種理想的細胞培養支架材料。目前，在細胞3D培養領域，RADA16多集中于癌細胞培養或干細胞培養。早年Kakiuchi等[9]證實將人類粒細胞白血病HL-60細胞培養于0.01%RADA16水凝膠中時，細胞可經誘導分化成單核細胞/巨噬細胞。而將小鼠的胚胎干細胞(R1細胞)和誘導性多能干細胞(TTF-1細胞)培養在該支架中時，發現支架中的干細胞多巴胺能神經元分化較普通二維(two dimensional, 2D)培養顯著增加，且這些分化的神經元能表達特定的多巴胺能標志物[10]。同樣，證實RADA16可用于皮下脂肪源性祖細胞的3D培養，在心臟誘導分化培養基作用下，細胞在RADA16水凝膠中呈簇聚集生長，同時表達相應的心臟發育標志物(如GATA14、TBX5、MEF2C、ACTN1等)[11]。在卵巢癌A2780細胞的體外3D培養中，RADA16作為良好的生長支架供其黏附、增殖以及表達相應的細胞黏附分子和血管生成因子[12]。

納米自組裝短肽的另一大優勢特點是其結構的可修飾性。隨著研究深入，研究者們設計利用不同的功能肽序列來對短肽RADA16進行改造，進一步優化其性能和運用。神經營養因子(BDNF)的衍生肽(序列RGIDKRHWNSQ)與RADA16的C端連接形成新的RADA16-BDNF三維肽支架，將人臍帶間充質干細胞與活化的星形膠質細胞共培養于該支架中，不僅可促進典型的神經元樣細胞分化，同時還能減少腦損傷周圍的反應性膠質增生[13]。將連接了功能序列的RADA16-RGD水凝膠與RADA16進行混合，并用于小鼠胚胎成骨細胞前體MC3T3-E1細胞的培養，結果表明該混合培養的方式可促進細胞黏附、增殖和成骨分化[14]。Luo等[15]將轉染了人神經源性營養因子(hBDNF)的骨髓間充質干細胞培養于修飾了功能基序PRG的RADA16短肽水凝膠中時，發現無論是細胞增殖活性、hBDNF蛋白表達，還是神經元特異性烯醇化酶、膠質纖維酸性蛋白的表達均高于單純用RADA16短肽水凝膠培養細胞的實驗組。

材料科學、組織工程、細胞生物學等學科的技術進步推動了細胞3D培養技術的發展。到目前為止，納米自組裝短肽RADA16及其衍生材料已用于培養多種不同的組織和細胞系，與2D細胞培養相比，其3D細胞培養技術是一項相對較新的技術，但應用于臨床模型的研究目前仍較少。

2 藥物/蛋白緩釋

目前，在難溶性藥物相關制劑開發中，納米載藥系統是主要研究對象，其雖具有可改進藥物水溶性、能進行靶向修飾、增強生物利用度等特點，但部分納米載體可能存在生物相容性、降解性較差等問題，因而其運用仍存在一定局限性[16]。作為一種新型生物材料，短肽RADA16由天然氨基酸合成，其結構簡單可控，以及可在體內生物降解且具有良好生物相容性等特點，以其為載體的藥物遞送系統的研究逐漸增多[17]。目前，在已設計出的各種類型的納米自組裝短肽中，運用于藥物傳遞載體的短肽，研究最多的是離子互補型自組裝短肽中的RADA16、EAK16及其衍生短肽[18]。

RADA16包含一個親水面和疏水面，在分子力作用下，其疏水表面可與難溶藥物的疏水區域相互作用形成短肽—藥物復合物，增強藥物在水溶液中穩定性的同時，使得難溶藥物能以自組裝短肽為媒介進行包載和緩釋；此外，RADA16在生理條件下形成的短肽水凝膠具有一定黏彈性，這對藥物起到一定緩釋作用[18]。目前，在自組裝短肽作為難溶藥物載藥系統的相關報道中，以研究模型水難溶性藥物芘和抗腫瘤相關藥物的報道居多。Tang等[19]發現化合物芘與RADA16相互作用時可形成膠態懸浮液，藥物以微晶形式包載于短肽自組裝形成的非極性的微環境中，初步證明RADA16與水難溶藥物之間存在疏水相互作用。在抗腫瘤藥物緩釋載體的應用當中，唐富山等[20]初步證實RADA16自組裝短肽具有作為抗腫瘤藥物原位水凝膠載體并運用于體內的潛力，并將其應用于芒果苷原位水凝膠抗腫瘤細胞增殖作用中[21]。此外，該團隊在RADA16基礎上設計出具有不同疏水側鏈的新型自組裝肽RVDV16，研究結果表明RADA16與RVDV16均可與大黃素形成相對穩定的懸浮液，在生理條件下形成原位水凝膠，而大黃素通過該原位水凝膠維持甚至增強對腫瘤細胞的增殖抑制作用[22]。除此之外，將抗腫瘤藥物附著在RADA16短肽結構上還可能發揮許多釋藥優點，如改良藥代動力學，或者通過靶向作用改善藥物的生物分布等[23]。

除了難溶性藥物，對于水溶性藥物來說，自組裝短肽RADA16也是一種良好的釋藥載體。RADA16曾廣泛運用于水溶性蛋白類藥物(如溶菌酶[24]、功能性蛋白質血管內皮生長因子[25]、轉化生長因子-β1[26])和非蛋白類水溶性藥物(如奎寧、吲哚洛爾[27])等的釋放。與疏水藥物的載藥機制不同，水溶性藥物是在短肽帶電氨基酸的電荷作用下連接于肽側鏈上并緩慢釋放。既往研究表明兩親性聚合物通常更有利于多肽和(或)蛋白的穩定[28]，因此具有兩親性的自組裝短肽RADA16在包載和釋放藥物的過程中不會對蛋白質本身的結構造成改變，并且在一定程度上還利于蛋白質活性的保持。但值得注意的是，由于RADA16帶電氨基酸的電荷性，當作為蛋白質藥物的遞送載體時，其釋藥速率可能與蛋白質表面所帶的電荷有關。此外，通過調整RADA16濃度亦會改變其水凝膠的流變學特性和藥物釋放速率等[18]。

綜合來看，影響納米自組裝短肽RADA16發揮釋藥效應的因素除了其自身形成的納米纖維網格結構、兩親性特點及帶電荷性質外，還與藥物本身的理化特性等相關。作為一種新型生物材料，雖然目前對自組裝短肽RADA16的載藥研究仍停留在體外研究，但有理由相信該材料在載藥領域的發展前景是巨大的。

3 再生醫學/組織修復

在組織工程中，通常認為細胞、支架和信號生物分子是組織工程的三個主要組成要素。支架起著承載介導細胞反應和信號生物分子的關鍵作用，選擇合適的支架，可為再生細胞的生存、增殖和分化提供更為有利的3D微環境。納米自組裝短肽RADA16具有良好生物相容性、降解產物可控及無免疫原性等特點，易通過固相方法合成且易修飾，不僅可以作為多種細胞的3D生長支架，同時還可作為修復損傷和維持機體組織功能的生物替代物，是組織工程中運用較為廣泛的一種新型生物材料，目前多應用于神經組織、骨組織、皮膚組織等領域的再生研究[29]。

3.1 神經組織修復

神經損傷易造成神經功能缺損，隨著醫學發展，生物工程技術為神經損傷的修復提供了新的途徑。早年呂斐等[30]通過構建脊髓損傷動物模型，發現RADA16短肽溶液對急性脊髓創傷組織具有一定的保護作用；將其應用于大鼠橫斷喉返神經損傷的再生修復亦是有效的[31]。短肽RADA16可為包括神經細胞在內的多種干細胞提供適宜生長和分化的3D微環境，近年來多項研究表明，通過結合各種功能肽序列基序，可以制備性能更加優越的納米自組裝肽纖維支架。來自天然蛋白質的附加功能基序具有多種生物活性，如促進細胞黏附[32]，促進神經突起生長[33]，促進成骨細胞增殖、分化和遷移[34]等。將功能序列RGD和IKVAV設計修飾在RADA16短肽結構上形成RADA16混合短肽并用于大鼠顱內出血修復當中，發現RADA16混合短肽水凝膠在促進神經纖維生長的同時，還可減少細胞凋亡、抑制膠質細胞高表達并降低免疫反應[35]。在SD大鼠坐骨神經缺損、腦出血、脊髓橫斷3種模型中，RADA16-IKVAV/-RGD可顯著修復神經損傷[36]。近來，有研究者將RADA16水凝膠與修飾了血管內皮生長因子和腦源性神經營養因子模擬肽序列的功能肽RADA16水凝膠混合后用于周圍神經重建，相關實驗表明，該混合水凝膠支架與單獨表達血管內皮生長因子或腦源性神經營養因子模擬肽表位的支架相比，能更有效促進雪旺細胞的前髓化，以及內皮細胞的黏附和增殖[37]。將RADA16-SVVYGLR水凝膠用于斑馬魚腦損傷動物模型研究中，發現該水凝膠支架能夠支持神經干細胞的生長增殖，除了促進新生血管和發育神經生成外，還增強斑馬魚視頂蓋功能區域的恢復[38]。

3.2皮膚組織修復

在皮膚組織的修復中，ECM與炎癥因子、細胞因子、生長因子等協同合作完成創傷修復的過程[39]。其中ECM能夠連接和支撐細胞，維持細胞的生物學行為，同時保護修復細胞，促進受損表面形成膠原層，以及促進傷口收縮，并修補破損的結構組織等[40]。與傳統聚合物修復材料相比，納米自組裝肽的結構具有仿生性質，更類似于天然ECM環境，利于功能型細胞在受損部位進行增殖、遷移、分化等，有助于傷口縫隙組織的再生。孟輝等[41]利用RADA16納米短肽纖維為修復材料進行皮膚燒傷動物模型的創面修復，結果顯示RADA16治療組中，燒傷創面及傷口周圍的毛發生長和早期分化表皮干細胞標志物角蛋白19的表達均優于殼聚糖修復組、膠原修復組及空白對照組，其修復機制可能是RADA16水凝膠為創面修復提供了模擬體內ECM的微環境，并且其高含水量特性可以使得創面保持一定濕潤，有利于各種腺體及細胞的再生和修復，同時也利于修復后期的膠原蛋白重新排列。Bradshaw等[42]將功能肽FPG(序列FPGERGVEGPGP)連接于RADA16短肽末端并應用于皮膚創面修復，通過檢測角化細胞和真皮成纖維細胞的增殖情況和遷徙情況，發現該短肽材料可加強細胞遷徙，并能夠明顯促進傷口愈合。亦有研究以RADA16水凝膠作為載體，應用于小鼠皮膚源性前體細胞再生并取得成功[43]。此外，有研究者將RADA16水凝膠支架與其自主開發的3D彈性支架PLCL結合用于皮膚缺損修復研究當中，發現在RADA16末端修飾添加了P物質(一種存在于脊椎動物神經系統中的氨基酸神經肽)的實驗組，其血管生成能力、間充質干細胞募集能力等都優于RADA16未修飾組，故認為該組合支架可用作真皮再生過程中的替代物[44]。

3.3 骨組織修復

理想的骨組織修復材料除了應具備生物相容性良好的特點外，其產物還應可降解，同時具有良好的骨傳導性和骨誘導性。傳統骨修復的材料如聚合物、金屬材料、生物玻璃和生物陶瓷等，因其低成骨活性、低生物相容性和低降解速率等缺點，無法形成具有生物功能的骨組織，難以從根本上實現修復缺損的功能[45]。研究者將RADA16短肽水凝膠應用于SD大鼠頭頂骨損傷模型研究，通過X光檢測發現有新骨生成填充，證明RADA16能有效修復骨損傷[46]。在SD大鼠股骨髁缺損修復中，RADA16短肽水凝膠能促進缺損部位生成更為成熟的新生骨組織，同時還顯示出一定的儲存和釋放堿性成纖維細胞生長因子的潛力，促進骨愈合[47]。在對自組裝短肽RADA16的C末端進行修飾后，可有效提高成骨前體細胞黏附、增殖以及成骨分化能力[48]。在RADA16的 C端添加KPSS生物活性基序(序列GGKPSSAPTQLN)后，既可促進骨髓間充質干細胞增殖、分化和趨化遷移，在體外培養的椎間盤模型中，還可在移植后很長一段時間內保持活力，發揮一定的椎間盤缺損修復效果[49]。值得注意的是，雖然RADA16在骨組織工程中發揮出了良好的修復潛力，但由于RADA16水凝膠的機械力相對較弱，在面對較大的骨缺損或負重骨缺損時，還不能提供足夠的機械支撐。因此，若能將RADA16支架材料與其他具有良好機械強度的材料相結合，在骨組織修復應用上將可能取得更好的治療效果。

3.4 其他組織修復

除以上組織工程修復的應用外，早期亦有納米自組裝短肽RADA16成功用于角膜組織損傷的修復的報道[50]。Takeuchi等[51]用2.5%RADA16短肽水凝膠填充大鼠第一磨牙缺損部位，發現RADA16明顯促進牙周缺損愈合。此外，RADA16及其衍生物亦可用于牙周韌帶組織再生[52]、血管生成[53]等的修復。

4 其他方面應用

納米自組裝短肽RADA16-Ⅰ最早由美國麻省理工學院和香港大學的Ellis-Behnke小組發現可用作止血劑[54]。Song等[55]研究發現，2%RADA16水凝膠在大鼠腎切除模型中的止血效應與天然高分子材料吸收性明膠海綿一致，但短肽水凝膠在發揮止血效果的同時，更能減少材料所帶來的組織炎癥反應。需要注意的是，生物材料在發揮止血功能的同時，其血液相容性是否良好亦十分重要。Taghavi等[56]研究分析了不同濃度(0.1%，0.2%，0.3%和0.5%)條件下RADA16的血液相容性，結果表明該材料與血液接觸時血液的組成沒有發生變化。在臨床前期的動物實驗中，RADA16水凝膠在兔腹主動脈穿刺出血模型中亦能發揮良好的止血效應[57]。截至目前RADA16是納米自組裝短肽止血材料中研究最深入應用最廣的一種材料，其商業產品PuraMatrix也逐漸應用于科研實驗和臨床前期研究。隨著探索深入，研究者們設計挑選出不同的功能肽基序與RADA16短肽結合，研發出了止血效應更優良的衍生材料，如RADA16-GRGDS和RADA16-YIGSR，二者能夠在大鼠肝臟打孔出血模型中發揮更優異的止血效果[58]。此外，也有研究報道利用基因重組技術將類彈性多肽ELP融合到RADA16氨基酸序列上，可形成具有優于膠原材料止血效應的RADA16功能肽[59]。

除了止血，納米自組裝短肽RADA16亦可應用于抗菌肽的相關研究當中。抗菌肽是大多數生物體內產生的抵抗病原體的小分子肽類活性物質，是機體內天然免疫防御屏障的重要組成部分[60]。目前已分離鑒定出兩千多種抗菌肽，以動植物、細菌來源的天然抗菌肽為主要來源。天然抗菌肽一般由10～60個氨基酸殘基組成，具有兩大特征結構：帶正電荷的氨基酸殘基和疏水氨基酸殘基[61]。天然抗菌肽存在產量較低、生產成本高等問題，故研究者們通過設計抗菌肽片段、改變氨基酸序列等途徑來不斷探索產量更高、甚至具有更高抗菌活性的人工抗菌肽。早年有將納米自組裝短肽材料用于抗菌肽設計與研究的代表性報道[62-63]。雖然納米自組裝抗菌肽的抑菌機制目前尚未完全闡明，但可以了解到的是自組裝短肽結構中的正電性和疏水成分在其抗菌作用中起重要作用：細菌具有聚陰離子表面，而納米自組裝抗菌肽的結構特點使其能與細菌細胞膜表面負電荷產生靜電作用，從而穩定吸附于細菌細胞膜上，隨后其疏水鏈段與脂質膜疏水相互作用，細胞膜通透性增加，胞膜裂解，抗菌肽進入細胞內作用于胞內酶、蛋白質、DNA 等物質，達到抑制細菌生長的作用[64-65]。而近年來，對離子互補型自組裝短肽抑菌活性的探索研究亦有不斷新發現。李會林等[66]探究不同濃度RADA16對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸埃希菌三種常見菌株的抑菌效果，發現0.25% RADA16短肽水凝膠短時間內即能發揮良好的抑菌活性。將RADA16短肽水凝膠與具有良好抑菌能力的陽離子抗菌肽結合，用于體外抑菌實驗探索，發現RADA16水凝膠形成的穩定結構為抗菌肽的持續釋放作用提供了重要載體平臺，不僅可以抑制金黃色葡萄球菌繁殖，還可一定程度促進骨髓間充質干細胞增殖，增強其成骨能力[67]。

若能進一步深入結合自組裝短肽具有的獨特自組裝特性、化學修飾廣泛可能性等特點，納米自組裝抗菌肽材料的研究將有可能為解決抗生素、抗菌劑等持續使用產生的耐藥性問題開辟新的解決途徑。

5 小結與展望

作為一種人工合成的新型納米生物材料，自組裝短肽RADA16成分純凈、性能穩定、無免疫原性且降解產物無毒、具有較好的生物相容性，是理想的細胞培養支架材料。RADA16擁有與ECM相似的3D微結構，不僅可為細胞提供適宜生長的立體微環境，也能促進受損組織和器官修復與重建。作為一種可裝載水難溶性藥物、水溶性藥物的智能載體，其在藥物和(或)蛋白緩釋運用上也具有一定的潛力。不難發現，納米自組裝短肽RADA16之所以能夠發揮優越性能，與其本身的自組裝特性、理化性質及形成的具有仿生性質的3D空間結構相關。