草莓根腐病土壤拮抗放線菌的篩選

陸錚錚 熊仕俊

摘 要：為獲得草莓根腐病病原菌的拮抗放線菌，從草莓根圍土壤中分離放線菌，采用平板對峙法篩選出了2株對草莓根腐病病原菌具有拮抗作用的生防放線菌。結果顯示：同時對峙的平均抑菌直徑分別是F3-8為20毫米、F2-2為17毫米;錯時對峙的平均抑菌直徑分別是F3-8為32毫米、F2-2為28毫米。

關鍵詞：草莓根腐病;擬盤多毛孢屬;拮抗;放線菌

草莓為薔薇科草莓屬多年生草本植物，富含維生素以及礦物質，營養價值高。中國是世界上種植面積最大、產量最高的草莓生產國[1]。隨著草莓種植區的擴大，草莓病害對草莓產量及品質的影響也越來越嚴重，草莓根腐病就是其中一種危害較嚴重的病害。

草莓根腐病（Strawberry root rot）是一種典型的土傳性病害，在世界各地的草莓種植區均有發生，能引起根部發生病變的病害，嚴重時產生缺株現象，影響草莓的生產，甚至出現絕產現象。草莓根腐病的致病菌有多種，其中由擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）引起的草莓根腐病在國內常有報道[2]，且危害嚴重。

化學農藥防治草莓根腐病成為傳統的防治該病害的方法，但是農藥對環境和人畜的危害較大。因此，筆者通過分離草莓根圍土壤中的放線菌，采用平板對峙法將放線菌和草莓根腐病病原菌進行對峙培養，篩選出拮抗放線菌，進而研究無公害的綠色防治方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 草莓根腐病病原菌來源于安順學院微生物學實驗室，用PDA培養基培養擴大培養菌種備用。

1.1.2 土壤樣品 采集于貴州省安順市大寨村草莓種植地發生根腐病的種植區中健康草莓植株的根圍土壤，共5份。

1.1.3 培養基[3] 病原菌的擴大培養：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）;土壤放線菌的分離：高氏合成1號培養基;土壤放線菌的純化：燕麥粉培養基;平板對峙： 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離方法 采用組織分離法，將采回的草莓根腐病病株，用無菌水清洗發病的部位，選取新近發病部位一小塊組織（0.5厘米×0.5厘米），經75%酒精消毒10～15秒后用無菌水洗3次，置于滅菌的放有濾紙的培養皿中，將組織表面多余的水分吸干，用滅菌的解剖刀和鑷子將組織切成4～5毫米的小塊，置于PDA培養基中培養，一個培養基可以放置3塊病組織，置于28 ℃恒溫培養箱培養3天后，進行純化，采用柯赫氏法則確定病原菌，并采用形態學和分子生物學相結合的方法鑒定病原菌菌株。

1.2.2 土樣采集方法 選取種植年限較長且發病較重的草莓種植地，采集健康草莓植株的根圍土壤。取樣時撥開表土約5厘米深，每樣約50克（同地區取樣點至少相距100米以上），裝入自封袋并做上記號，帶回實驗室。

1.2.3 土壤放線菌分離方法 將采回的土壤放于干燥無菌的地方晾7天后進行分離。稱10克土樣置于盛有90毫升無菌水三角瓶中（瓶里放幾粒無菌玻璃珠），用搖床充分振蕩15分鐘后靜置10分鐘。取1毫升懸浮液于9毫升無菌水中，再從中取1毫升于另一支9毫升無菌水中混勻，再稀釋。如此類推就得到不同稀釋倍數的土壤懸浮液（分離放線菌所需稀釋倍數為10-2、10-3、10-4）。從各濃度的土壤懸浮液中吸取0.1毫升懸浮液分散滴于高氏合成1號平板上，再用滅菌的三角玻璃棒涂勻，靜置20分鐘后于32 ℃的恒溫培養箱中倒置培養，待菌落形成后立即純化并保存。

1.2.4 拮抗放線菌的篩選方法 （1）對峙培養：用滅菌的接種針挑取一小塊放線菌置于PDA培養基的一側，用打孔器將草莓根腐病病原菌制作成直徑為5毫米的菌蝶，將菌蝶接種于PDA培養基的另一側（培養基的直徑為7.5厘米），置于32 ℃恒溫培養箱中培養，3天后觀察。（2）同時對峙：是將放線菌和病原菌同時接種于PDA中。（3）錯時對峙：將放線菌接在PDA平板一側，于28 ℃恒溫培養箱培養，待放線菌已在培養基上定殖和產孢后（約7天），再接種病原菌于培養基的另一側。（4）空白對照：培養基的一側只接種病原菌，不接種放線菌。

1.2.5 抑菌直徑的測量方法 抑菌直徑=空白對照組平均生長出來的病原菌菌落直徑-具有放線菌對峙的培養皿中的平均長出的病原菌菌落直徑;平均抑菌直徑=重復的抑菌直徑之和/重復的次數。

2 結果與分析

從采集的5份健康草莓根圍土壤中分離得到22株放線菌，經過平板對峙篩選得出2株對草莓根腐病病原菌具有拮抗作用的放線菌。其編號分別為F3-8、F2-2。2株放線菌對草莓根腐病病原菌的平均抑菌直徑如表1所示;同時接種的平板對峙效果如圖1所示;錯時接種的平板對峙效果如圖2所示。

由表1和圖1、圖2可以看出，無論是同時對峙還是錯時對峙，這2株放線菌對草莓根腐病病菌都有一定抑制作用，其中 F3-8拮抗放線菌對草莓根腐病的抑制作用最佳。從同時對峙和錯時對峙對比效果看，2株拮抗放線菌都是在錯時對峙中發揮較大的抑制作用。

3 討 論

通過分離草莓根圍土壤中的放線菌，采用同時和錯時的平板對峙法篩選出了2株拮抗放線菌，其結果為：同時對峙的平均抑菌直徑F3-8為20毫米、F2-2為17毫米;錯時對峙的平均抑菌直徑F3-8為32毫米、F2-2為28毫米，病原菌在沒有拮抗放線菌抑制的狀態下，培養3天后，菌株直徑可達61毫米，將拮抗放線菌共同培養后，病原菌的生長受到了明顯的抑制，其中放線菌F3-8的抑制效果比放線菌F2-2的抑制效果更佳。同時結果還表明：2株拮抗放線菌均顯示在錯時對峙的抑制效果比同時對峙的抑制效果更好，說明放線菌需要在培養基上定植或產生抗生素之后對病原菌的抑制效果會更佳，因此在大田試驗時，需要用拮抗放線菌的菌液浸根后移栽，這樣效果最佳。

引起草莓根腐病的病原菌可達20多種，主要有鐮孢屬、疫霉屬、炭疽菌屬、絲核菌屬、柱孢菌屬、擬盤多毛孢屬、終極腐霉屬等真菌[4]。利用拮抗細菌和真菌對草莓根腐病的防治也常有報道，如姚錦愛[5]等報道的菌株 ZZBV-3 是草莓根腐病病原菌尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 的優良拮抗細菌;王夢園報道[6]，篩選出了3株對新棒狀擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）引起的草莓根腐病病原菌具有較好拮抗效果的生防細菌。張鶴[7]報道的木霉菌對由茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）引起的草莓根腐病病原菌產生較強的抑制作用。但是，利用拮抗放線菌作為草莓根腐病病原菌拮抗菌的研究鮮有報道，因此筆者在本研究中篩選出的2株拮抗放線菌對草莓根腐病的生物防治研究具有重要的意義，為綠色防治提供了重要的生防菌株，后續將進一步開展這2株拮抗放線菌的鑒定和拮抗機制的研究工作。

參 考 文 獻

[1]? 張曉慧.草莓病害研究進展[J].安徽農學通報，2018，24（18）： 52-57.

[2]? 劉艷茹.草莓擬盤根腐病病原菌鑒定及其防治藥劑篩選[D].沈陽：沈陽農業大學.2020.

[3]? 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998：46-49.

[4]? 尹沙亮，鐘珊，劉奇志，等.草莓絲核菌根腐病病原菌鑒定及7種殺菌劑的抑菌作用測定[J].植物保護，2019，45（4）：132-136.

[5]? 姚錦愛，黃鵬，賴寶春，等.億貝萊斯芽胞桿菌ZZBV-3的鑒定及其對草莓根腐病的防效[J].中國生物防治學報，2021，37（1）：172-177.

[6]? 王夢園.草莓重茬病原菌的分離及其拮抗菌的篩選與應用[D].荊州：長江大學，2020.

[7]? 張 鶴，杜國棟，宋亞楠，等.防治草莓根腐病的木霉菌篩選、鑒定及其防病效果[J].沈陽農業大學學報，2015，46（6）：654-660.