blaKPC耐藥基因在肺炎克雷伯菌中的傳播機制研究

賈阿韶 綜述 余廣超 審校

暨南大學附屬第一醫院臨床檢驗中心，廣東 廣州 510630

KPC型碳青霉烯酶作為A類碳青霉烯酶中最常見的一種酶類，能夠水解包括碳青霉烯類在內的所有β-內酰胺類抗菌藥物[1]。blaKPC基因是KPC型碳青霉烯酶的編碼基因，blaKPC基因的傳播可以通過不同的分子機制來介導，通過可移動遺傳元件(如質粒等)介導是其中很常見的一種傳播機制，亦可由染色體介導或克隆等方式進行傳播[2]。近期有研究發現，耐碳青酶烯肺炎克雷伯菌(CRKP)所導致的血流感染發生率和死亡率均呈上升趨勢[3-4]。因此，從基因水平研究產KPC型碳青霉烯酶的傳播機制對于控制和延緩細菌耐藥性的傳播具有重要意義。本文主要就blaKPC基因通過可移動遺傳元件進行傳播的相關研究做一綜述。

1 質粒介導的blaKPC耐藥基因傳播機制

質粒是一種存在于染色體以外的核酸分子，具有自我復制以及在細菌之間進行轉移的特征。質粒本身攜帶有一些特殊基因，可用于表達特定的功能，包括耐藥基因、毒力基因等，雖然這些基因對于細菌的生存不是必要的，但其存在對于細菌適應生存環境的改變往往有所裨益[5-6]。耐藥基因通過質粒介導的傳播較之染色體更具有靈活性，傳播速度也更快，這一特性使得攜帶KPC耐藥基因的質粒更容易造成在腸桿菌科細菌間的水平傳播，從而導致了產酶菌株的快速播散[7-8]。

質粒上存在各種抗菌藥物的抗性基因，即耐藥基因，這些耐藥基因的積累是由于在多種抗菌藥物的選擇壓力下各種復雜的移動元件水平轉移事件導致的[9]。質粒作為介導耐藥基因進行傳播的一種媒介，其傳播方式是多樣的，通過質粒接合作用介導耐藥基因的水平傳播是其中最常見的一種方式，接合作用可以使得耐藥質粒從耐藥菌株成功轉移至敏感菌株，這種轉移方式不僅可以造成耐藥基因在同種菌株間的快速播散，甚至可以造成不同種屬間的快速播散[10-11]。質粒分子量大小不同，通過估算質粒的分子量大小，有助于研究耐藥性質粒的傳播及其進化的過程。肺炎克雷伯菌中KPC酶基因位于不同大小的質粒上，攜有耐藥基因的質粒可以從數十kb到數百kb不等，故此可以推斷質粒在介導耐藥基因進行水平傳播的過程中很有可能出現了重組事件或插入事件，這種可能的存在導致質粒的水平轉移可以從外界獲得耐藥基因，加快了質粒介導的耐藥基因在細菌間的傳播進程。

截至目前，據全質粒測序分析發現攜帶blaKPC耐藥基因的質粒有近50種，KPC的blaKPC耐藥基因最常見于IncF型質粒上[12]。希臘曾暴發過由IncFⅡK質粒介導的產KPC-2酶大腸埃希菌(ST410)的廣泛流行，在此之前，該質粒曾介導過肺炎克雷伯菌在希臘的廣泛傳播[13]。有研究發現，腸桿菌中有4個屬6個種的耐碳青霉烯酶腸桿菌的blaKPC耐藥基因均存在于pUVA01質粒上[14]。介導blaKPC耐藥基因傳播的質粒具有廣譜宿主性和多樣性。

介導blaKPC耐藥基因傳播的質粒具有廣譜宿主性和多樣性，質粒的某些特性賦予了它更多的傳播方式，使其介導耐藥基因的傳播過程也變得更容易，從而更易導致耐藥菌的廣泛流行。

2轉座子介導的blaKPC耐藥基因傳播機制

轉座子(Tn)是指能將自身基因插入基因組中任何一個序列的一組DNA序列，它可以在基因組上進行自由移動[15]。轉座子可以介導β-內酰胺酶基因，通過水解β-內酰胺類抗生素，從而導致blaKPC耐藥基因的水平傳播[16]。

據流行病學調查報告表明，轉座子Tn4401是歐美地區最常見的攜帶blaKPC的基因元件[17]。Tn4401轉座子全長10 kb左右，其結構組成包括blaKPC-2基因、轉座酶基因(tnp A)、解離酶基因(tnp R)和ISKpn6、ISKpn7兩個插入序列。Tn4401序列兩邊有5 bp的靶位復制序列，可以攜帶著blaKPC以較高的頻率插入到不同質粒的開放讀碼框(ORF)中，這就使得blaKPC耐藥基因得以在相同菌種甚至不同菌種間實現快速播散，因此Tn4401被認為加速了產酶菌株的全球擴散[18-19]。不同于歐美地區，在我國，復合轉座子Tn3-Tn4401和轉座子Tn1721是國內產菌株最常報道的攜帶blaKPC耐藥基因的基因元件，尤其是在江浙地區報道的菌株中經常出現。這種復合轉座子被認為是基于Tn3的轉座子和部分Tn4401結構的整合，其ORF順序為：Tn3轉座子的Tn3-轉座酶和Tn3-解旋酶、ISKpn8、blaKPC-2基因和ISKpn6樣元件，該轉座子僅有2 070 bp的區域與Tn4401相同，包括blaKPC-2基因和類似ISKpn6的ORF[20]。位于復合轉座子Tn3-Tn4401中ISKpn8插入序列下游的blaKPC-2耐藥基因，往往是以Tn3-Tn4401復合轉座子的整體形式進行轉移，而非單獨隨ISKpn8一起移動[20]。Tn1721轉座子是我國早期報道的與blaKPC基因傳播有關的轉座子，最近有研究表明，我國東部地區blaKPC-2基因主要位于2種Tn1721轉座子亞型，其分別被命名為Tn1721A和Tn1721B；Tn1721A的結構與Tn1721B的不同之處在于Tn1721A不包含額外的IRL和IRL2等附加的反向重復序列[21]。無論blaKPC-2耐藥基因是位于轉座子內部還是外部，都可隨Tn1721轉座子運動，通過轉座子插入到質粒中來介導耐藥基因的水平傳播，但相較于轉座子Tn4401無特異性的插入位點，轉座子Tn1721插入位點基因的周圍環境表現為AT含量由兩端向中間遞減的趨勢[21]，這表明轉座子Tn1721的插入位點可能更具特異性。此外，有研究發現含blaKPC-3基因的Tn4401轉座子可直接插入到一個復合轉座子Tn1331中[22]。

攜帶KPC基因的Tn4401轉座子可直接插入到質粒中進行傳播，融入質粒的轉座子結構大多保持了其自身的轉座能力，同時也可以隨質粒接合轉移進行傳播。這種傳播方式在介導blaKPC耐藥基因進行水平傳播的過程中存在著至關重要的作用。

3 整合子介導的blaKPC耐藥基因傳播機制

整合子是存在于很多細菌中的一種具有運動屬性的DNA分子，常定位于質粒、染色體和轉座子上，其具有獨特的結構可以捕獲外源基因特別是耐藥基因并穩定表達，以此來提高細菌對周圍環境改變的耐受性。整合子可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子，intI1、intI2、intI3分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的遺傳標記。研究表明，攜帶blaKPC基因的肺炎克雷伯菌對抗生素具有耐藥性與Ⅰ、Ⅱ類整合子密切相關，與Ⅲ類整合子相關性不大[23-24]。blaKPC耐藥基因以基因盒的形成位于整合子可變區，可隨整合子在不同細菌之間水平傳播。攜帶耐藥基因的整合子隨其他可移動遺傳元件(如轉座子等)融合到質粒上，從而介導耐藥基因在不同菌株間發生水平傳播。

4 插入序列介導的blaKPC耐藥基因傳播機制

插入序列(IS)是編碼轉座酶的一段DNA序列，大小一般在600～2 000 bp，可看成一種簡單形式的轉座子。有研究認為在轉座子Tn4401的形成過程中，ISKpn6和ISKpn7分別插入到blaKPC上下游，破壞IRR1，從而形成一個完整的轉座子Tn4401[19]，并隨轉座Tn4401轉移到質粒上介導耐藥基因的水平傳播。

被插入序列插入的位點基因可因受損不再表達而導致基因失活，稱為插入失活(insertional inactivation)[25]，從而使細菌產生對抗生素的耐藥。甚至可因此而產生一種轉座子突變體，如：國內曾報道了轉座子Tn1721的突變體，就是由于IS26在Tn3的tnpA插入導致tnpA丟失，形成了一種Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26樣的新結構[26-27]。

插入序列作為轉座子的一部分，可攜帶blaKPC耐藥基因隨轉座子轉移到質粒上介導耐藥基因的水平傳播[28]，亦可導致插入位點基因的失活，形成一種轉座子突變體，從而介導新的耐藥機制的產生。

5 噬菌體/噬菌體原介導的blaKPC耐藥基因傳播機制

噬菌體在自然界中含量豐富，其結構簡單，適應性強，容易在各種生存環境長期存活，因此它是耐藥基因轉移的最合適載體。噬菌體不僅可以介導耐藥基因在同一種屬細菌之間傳播，還可以介導耐藥基因的跨細菌種屬傳播，對細菌基因組的多樣性和進化發揮了重要作用[28]。

目前已在臨床肺炎克雷伯菌中發現了P7-like噬菌體并攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1[29]。有研究報道，存在于菌體中的噬菌體原(prophage)可以幫助大腸埃希菌拮抗β-內酰胺類藥物，這也許跟某些噬菌體原自身含有的耐藥基因有關，也可能是通過菌體中的某些特定蛋白抑制細菌的細胞分裂，使得細菌對抗生素的敏感性下降，從而介導細菌產生耐藥[30]。對于噬菌體原是否能通過類似機制來介導blaKPC基因進行廣泛傳播尚不清楚，噬菌體原介導耐藥基因的傳播機制需要進一步研究完善。

6 結語

blaKPC基因可以通過質粒、轉座子、整合子等可移動遺傳元件進行傳播，blaKPC基因在不同地區的流行可通過不同的可移動遺傳元件，或同種可移動遺傳元件中不同類型的小元件進行水平傳播，表明blaKPC基因環境與擴散轉移可能存在地域差異。目前關于blaKPC基因的具體播散規律尚不完善，因此需要更多的相關研究進行深入探索。可移動遺傳元件介導blaKPC基因水平傳播所導致的CRKP全球播散給公共衛生造成了極大的威脅，耐藥形勢十分嚴峻。當前各級醫院需加強院內感染的控制，合理使用抗菌藥物，以及定期進行環境清潔和設備消毒。