背角無齒蚌硒谷胱甘肽過氧化物酶基因的克隆及2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚和五氯苯酚對其表達的影響

袁鳳娟，魏夢薇，張慧子，王雯，邵向陽，李媛，董艷美，王夢琪，齊金旭，夏西超

平頂山學院醫學院，平頂山 476000

氯酚類化合物(pentachlorophenol, PC)廣泛應用于農藥、木材防腐劑和個人護膚品等工農業生產中。與此同時，氯酚類化合物是焚燒爐排放氣體中二噁英和多環芳烴的最直接前體[1]。目前，氯酚類化合物在地表水、地下水、污水和飲用水中都被不同程度檢測到，其可通過食物鏈放大效應在生物體內呈現持久性的蓄積效應，對個體生長、發育和繁殖帶來潛在的干擾作用，氯酚類化合物毒性機制研究已備受關注[2]。在氯酚類化合物中，2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)和五氯苯酚(PCP)大量存在于水體中，對水生生物和人類具有潛在的健康風險，并被國際上列入持久性優先控制污染物[3]。目前，2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP普遍存在于我國的河流之中，其中PCP最為廣泛[4]。研究證實，這些氯酚可以誘發水生生物的氧化應激、生殖毒性和內分泌紊亂[5]。氯酚誘發線粒體中氧化磷酸化解偶聯和活性氧自由基(ROS)生成是其主要毒性作用機制之一[5-6]。在健康生物個體中ROS保持相對較低的水平，并且ROS生成后會被抗氧化酶迅速清除。

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)是一類廣泛存在于生物體內的重要抗氧化酶，可將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，保護細胞膜結構及功能不受過氧化物干擾及損害，進而參與生物體內氧化還原穩態的調控過程。GPx主要包括含硒GPx(SeGPx)和不含硒GPx這2種類型。SeGPx可以還原有機和無機氧化物，能夠將過氧化氫(H2O2)還原為H2O；不含硒GPx只能還原有機氧化物[7]。雙殼類是軟體動物一個重要類群，常年棲息在海洋、河流和湖泊底部，以濾食生活為主，是檢測環境污染的重要指示性生物[8-9]。這些動物發育至成體后不做長距離遷移并在一個區域生活多年，完成生長、成熟和繁殖[8-9]。與其他水生生物相比，雙殼類動物在水體中污染物檢測中更具有代表性[8-9]。背角無齒蚌(Anodontawoodiana)廣泛分布于世界各地的淡水環境，在持久性有機污染物、殺蟲劑和重金屬等水環境污染檢測中常用作指示性生物；同時在水體凈化、顆粒物過濾、營養釋放和沉積物混合等方面也發揮著積極作用[10]。隨著水體污染的加劇，背角無齒蚌數量顯著減少，已在北美地區被列入瀕危生物。為了深入認識2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP對水生生物的毒性機制，本研究從背角無齒蚌分離出完整的SeGPx基因序列并命名為AwSeGPx，分析2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP對肝胰腺中AwSeGPx表達的影響，為揭示2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP毒理學效應提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產市場，2,4-DCP、2,4,6-TCP、PCP和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma-Aldrich公司，2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP溶解于DMSO中以制備儲備液。TRIzol試劑、M-MLV反轉錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產物回收純化試劑盒、RACE試劑盒均購自寶生物生物科技有限公司，其余常規藥品均為進口或國產分析純。

背角無齒蚌殼長6.5 cm±0.5 cm，置于實驗室自動水循環系統中適應養殖2周，期間停止進食。隨后，動物處理實驗在長方體的塑料盒(長×寬×高：40 cm×25 cm×10 cm)中進行，每個盒子里面8只河蚌，飼養采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)，喂食小球藻(Chlorellavulgaris)[10]。為了確定AwSeGPx基因的組織分布，對來自同一塑料盒內5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟和外套膜等組織，每個蚌每一個組織提取3次RNA，進行3次qPCR，取平均值，5個平均值加和后再次平均為AwSeGPx在該組織中的表達水平。

動物處理實驗過程中，640只河蚌動物分為對照組、2,4-DCP處理組(60、120、240、480和960 μg·L-1)、2,4,6-TCP處理組(50、100、200、400和800 μg·L-1)和PCP處理組(20、40、80、160和320 μg·L-1)，對照組用同體積去離子水處理。為確保動物有足夠數量取材，每一組設置5個平行盒子，每個盒子8只河蚌，分別在0、6、12、24和48 h時于每組中取出5只河蚌，解剖，液氮速凍，于-80 °C保存。

1.2 總RNA提取與cDNA模板制備

按照試劑盒說明書的要求，使用TRIzol法(Takara，大連)提取總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara，大連)合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增反應的模板。

1.3 AwSeGPx全基因序列的克隆

根據雙殼綱、腹足綱、昆蟲綱、甲殼綱和脊椎動物在內其他物種的SeGPx保守區域設計簡并引物SeGPx1和SeGPx2，用于擴增AwSeGPxcDNA片段，將PCR產物克隆到pMDT-19(Takara，大連)，采用雙向測序，鑒定為SeGPx部分序列。以部分cDNA序列設計特異引物(表1)，根據RACE試劑盒說明書，采用巢式PCR方法擴增AwSeGPxcDNA的5’和3’區域。擴增產物克隆載體、雙向測序、序列比對和拼接。

1.4 序列與系統發育的分析

在GenBank數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中采用BLAST方法對AwSeGPx序列進行了比對和分析；采用DANMEN軟件對AwSeGPx基因進行多序列比對；采用信號肽預測數據庫(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對AwSeGPx信號肽序列進行預測；采用SMART數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)對AwSeGPx蛋白質二級結構域進行預測；采用SWISS模型(http://swissmodel.expasy.org/)對AwSeGPx的三維結構進行預測；用MEGA 5.0鄰位連接方法，構建AwSeGPx系統進化樹。

表1 實驗過程中的引物Table 1 Description of the primes used in this study

1.5 real-time PCR定量檢測AwSeGPx的表達

為了確定AwSeGPx轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照說明書的要求進行定量分析。根據已有貝類內參基因研究結果，選取β-actin作為內參基因[10-11]，根據內參基因和AwSeGPx特異引物分別分離對應序列(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個擴增條帶，PCR產物回收、測序、鑒別；結合熔解曲線和擴增曲線結果確定內參基因和目的基因表達的特異性和高效性。使用ABI7500實時檢測系統(Applied Biosystems，美國)采用兩步法，進行real-time PCR，構建標準曲線，通過2-△△CT分析AwSeGPx表達水平。

1.6 統計學處理

2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP處理后AwSeGPx表達水平的差異采用單向方差分析(analysis of variance, ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 背角無齒蚌AwSeGPx分子結構

背角無齒蚌AwSeGPxcDNA全長由870個核苷酸組成(GenBank NO, KU821031)，包含一個36 bp的5’非翻譯區(UTR)、69 bp的3’UTR。開放閱讀框由585 bp核苷酸組成，編碼195個氨基酸的多肽鏈，分子量為22.04 kDa，理論等電點為8.70(圖1)。

圖1 背角無齒蚌AwSeGPx基因的cDNA序列和推導的氨基酸序列注：起始和終止密碼用粗體標示，終止信號“AATAAA”用波浪線標示，硒代半胱氨酸(U44)氨基酸殘基用方框標示，GPx標簽序列 (68LGFPCNQF75)和活性位點(156WNFEKF161)結合區域用灰色陰影標示，預測的硒插入片段(SECIS)用斜體標示， 谷胱甘肽結合位點的精氨酸(R94, R151)用加粗下劃線標示，催化的谷氨酰胺(Q74)和色氨酸(W156)用加粗并方框標示。Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AwSeGPx of Anodonta woodianaNote: The start and stop codons are indicated with bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the selenocysteine (U44) are marked with box; the GPx signature motif (68LGFPCNQF75) and active site motif (156WNFEKF161) are highlighted with shadow; the predicted SECIS element in the 3’UTR is marked with italic; the arginine residues (R94, R151) involved in binding glutathione are marked with underline and bold; catalytically important residues of Gln (Q74) and Trp (W156) are bold in a box.

終止信號(AATAAA)在3’UTR的838～843位點處。AwSeGPx氨基酸序列的第44位氨基酸為特殊的硒代半胱氨U(165TGA167)，這是SeGPx家族的主要特征。SignalP 3.0程序運行結果顯示，AwSeGPx的預測氨基酸序列中沒有信號肽(圖1)。

AwSeGPx的N端區域由一個包含8個氨基酸(68LGFPCNQF75)的保守結構域和1個谷胱甘肽過氧化物酶家族的活性位點(156WNFEKF161)(圖2)。固定硒元素的谷氨酸氨基酸殘基和1個色氨酸氨基酸殘基，以及負責將底物谷胱甘肽轉運至GPx催化中心的2個精氨酸殘基(R94, R151)(圖2)。

AwSeGPx與其他物種SeGPx序列具有高度的相似性，AwSeGPx蛋白質二級結構包含7個α-螺旋和7個β-折疊(圖3(a))。AwSeGPx三維結構排列和其物種SeGPx序列三維結構排列有很高的相似性，尤其是人的SeGPx序列(圖3(b))。

2.2 AwSeGPx插入片段(SECIS)預測

用SECISearch 2.19軟件預測背角無齒蚌AwSeGPx基因的3’-UTR有101 bp的硒代半胱氨酸插入片段(SECIS)，形成一個莖環狀的二級結構(圖4(a))。與盤鮑(Haliotisdiscusdiscus)SeGPx硒代半胱氨酸插入片段相比，相似度很高，都屬于二型硒插入片段，背角無齒蚌硒代半胱氨酸插入片段含有一個頂環，2個內環，2個折疊，保守的腺嘌呤(AA)在內環上。5’莖序列為UAUGAU，內環序列3’莖序列為UGA(圖4(b))。

圖2 背角無齒蚌AwSeGPx與其他物種SeGPx序列多重比對注：GPx標簽序列(68LGFPCNQF75)和活性位點(156WNFEKF161)結合區域用灰色陰影標示，硒代半胱氨酸(U44)氨基酸殘基用粗體 并下劃線標示，負責催化的谷氨酰胺(Q74)和色氨酸(W156)用粗體標示，谷胱甘肽結合位點的精氨酸(R94, R151)用下劃線標示。Fig. 2 Multiple alignment of AwSeGPx of Anodonta woodiana with other SeGPxNote: The GPx signature motif (68LGFPCNQF75) and active site motif (156WNFEKF161) are marked with shadow; the selenocysteine (U44) are bold with underline; catalytically important residues Gln (Q74) and Trp (W156) are indicated with bold; the arginine residues (R94, R151) involved in binding glutathione are marked with underline.

圖3 背角無齒蚌AwSeGPx二級和三維結構預測注：(a) AwSeGPx二級結構；(b) AwSeGPx的三維結構。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwSeGPx deduced amino acids of Anodonta woodianaNote: (a) Secondary structure of AwSeGPx; (b) 3D structure of AwSeGPx.

圖4 背角無齒蚌與盤鮑硒插入片段比較注：(a) 1型和2型硒插入片段的頸環結構；(b) 背角無齒蚌硒插入片段結構；(c) 盤鮑(Haliotis discus discus)硒插入片段結構。Fig. 4 Predicted secondary structure in SECIS of AwSeGPx of Anodonta woodiana and Haliotis discus discus Note: (a) Schematic representations of stem-loop structures of form 1 and 2 of SECIS; (b) SECIS of Anodonta woodiana; (c) SECIS of Haliotis discus discus.

2.3 系統發育分析

BLAST分析表明，AwSeGPx的氨基酸序列與其他物種SeGPx具有較高的同源性，與三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)的同源性為85.64%，與斑馬魚(Daniorerio)的同源性為64.80%，與盤鮑的同源性為30.26%。AwSeGPx與軟體動物親緣關系最近，其次是脊椎動物，最后是昆蟲和甲殼動物(圖5)。在已證實的軟體動物序列中，AwSeGPx進化關系最近的是淡水蚌類，其次是海洋蚌類和螺類(圖5)。

圖5 根據背角無齒蚌AwSeGPx氨基酸序列使用鄰接法構建的系統進化樹Fig. 5 Phylogenetic relation of AwSeGPx of Anodonta woodiana with other organisms

2.4 AwSeGPx的組織分布

實時定量PCR結果顯示，背角無齒蚌AwSeGPx在斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和心臟殼中廣泛表達(圖6)。AwSePGx在肝胰臟和心臟中存在高表達，外套膜、斧足和鰓中存在中等表達，閉殼肌中存在較低表達(圖6)。

2.5 急性毒性實驗

背角無齒蚌48 h急性毒性試驗結果表明，2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP對背角無齒蚌LC50為0.246、0.194和0.139 mg·L-1。

2.6 2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP對肝胰腺AwSeGPx表達的影響

2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP處理能夠顯著誘導肝胰腺中AwSeGPx的表達(圖7)。與對照組相比，用濃度60、120、240、480和960 μg·L-1的2,4-DCP處理后AwSeGPxmRNA水平48 h時比6 h時增加了1.79倍以上(P<0.05)(圖7)。

與對照組相比，用濃度50 μg·L-1的2,4,6-TCP處理后AwSeGPx水平在12、24和48 h時顯著升高，用濃度100、200、400和800 μg·L-1的2,4,6-TCP處理后AwSeGPx水平在整個實驗觀察過程中增加了1.01倍以上(P<0.05)(圖8)。

與對照組相比，用濃度20、40和80 μg·L-1的PCP處理后AwSeGPx水平在6、12、24和48 h顯著升高，AwSeGPxmRNA水平至少增加了62.65%(P<0.05)(圖9)。用濃度160 μg·L-1和320 μg·L-1的PCP處理后，AwSeGPxmRNA水平在6、12和24 h顯著升高，AwSeGPx水平在48 h下調并降至正常水平(圖9)。

圖6 背角無齒蚌AwSeGPx基因的空間表達注：每組數據來源于5只動物。Fig. 6 Real-time PCR analysis of AwSeGPx transcript from different tissues of Anodonta woodianaNote: n=5 replicates for each group.

圖7 2,4-DCP對背角無齒蚌肝胰腺AwSeGPx 基因表達的影響注：n=5/組/時間點；*、#表示與相應對照組相比有顯著差異 (P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Temporal expression of AwSeGPx in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after 2,4-DCP challengeNote: n=5/each group/each time point; *, # mean significant differences compared with control group at the same time at P<0.05, P<0.01 level.

圖8 2,4,6-TCP對背角無齒蚌肝胰腺 AwSeGPx基因表達的影響注：n=5/組/時間點；*、#表示與相應對照組相比 有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 8 Temporal expression of AwSeGPx in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after 2,4,6-TCP challengeNote: n=5/each group/each time point; *, # mean significant differences compared with control group at the same time at P<0.05, P<0.01 level.

3 討論(Discussion)

AwSeGPxcDNA編碼序列中包含一個無義密碼子TGA，提示AwSeGPx是SeGPx家族的一員。無義密碼子TGA編碼硒代半胱氨酸這一現象首次在小鼠GPx基因中發現，隨后在人類和大鼠中也得到進一步證實[12-13]。目前，已在雙斑馬紋貽貝(Dreissenapolymorpha)、扇貝類蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、菲律賓蛤仔(Venerupisphilippinarum)和盤鮑等軟體動物SeGPx中發現該密碼子的存在[14-16]。由此可見，硒代半胱氨酸是無脊椎動物到脊椎動物中SeGPx標簽位點，同時也是該酶催化的重要活性位點。AwSeGPx氨基酸序列中發現2個保守的SeGPx基因家族的標簽序列，分別是68LGFPCNQF75和156WNFEKF161，在這2個結構域中，Gln(Q)和Trp(W)常被視為GPx催化的重要活性位點，并參與硒元素的固定[17]。此外，多重對比結果顯示，AwSeGPx序列中Arg94和Arg151與其他SeGPx序列存在高度的同源性，這2個精氨酸殘基能夠通過靜電吸附效應將供體底物引導至催化中心[17]。SECIS元件是SeGPxmRNA序列的一個重要的特征性標簽，在翻譯過程中將能夠將Se引導至UGA密碼子位置[18]。AwSeGPxSECIS元件有101個堿基組成，包括1個頂環、2個內環、2個折疊、3個位于內環上腺嘌呤(AA)。已有研究顯示，SECIS元件主要有1型和2型這2種主要形式，在1型中，腺嘌呤區域位于頂環，而在2型中，則位于內環[19]。由此可見，AwSeGPx的SECIS元件屬于2型類別。

圖9 PCP對背角無齒蚌肝胰腺AwSeGPx基因表達的影響注：n=5/組/時間點；*、#表示與相應對照組 相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 9 Temporal expression of AwSeGPx in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PCP challengeNote: n=5/each group/each time point; *, # mean significant differences compared with control group at the same time at P<0.05, P<0.01 level.

AwSeGPx廣泛分布于鰓、外套膜、閉殼肌、斧足、心臟和肝胰腺中，提示AwSeGPx是一種幫助組織保持氧化還原作用平衡的重要酶；不同組織中的AwSeGPxmRNA水平差異與對抗不同環境中生成的ROS有關。在選取的組織中，AwSeGPx在肝胰臟中表達水平最高，與肝胰腺作為主要代謝器官和氧化應激防御功能器官密切相關[20]。

本研究結果顯示，PCP對背角無齒蚌的LC50低于2,4-DCP和2,4,6-TCP的，提示在相同的濃度條件下背角無齒蚌對PCP敏感性高于2,4-DCP和2,4,6-TCP。甲殼動物水蚤的急性毒性實驗結果顯示，2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP的LC50分別為286.2、341.5和11.4 μg·L-1，慢性毒性實驗結果顯示，2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP的LC50分別為16.3、54.6和3.9 μg·L-1[1]。在相同濃度條件下，PCP對水生生物毒性比2,4-DCP和2,4,6-TCP更強。研究證實，PCP可以在細胞和組織中通過氧化脫氯進一步轉化為其他物質，其中，PCP可被細胞色素P450氧化酶、還原酶催化形成四氯氫醌，四氯氫醌是一種毒性比PCP更強的代謝產物，可誘導DNA鏈斷裂并消耗谷胱甘肽，導致細胞和組織出現大量的ROS和氧化應激效應[21-22]。相對于PCP而言，水環境中的2,4-DCP和2,4,6-TCP化學性質非常穩定，能夠在土壤以及底泥介質中長期停留。

本研究結果顯示，不同濃度2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP處理能夠顯著誘導AwSeGPx表達水平的上調，提示AwSeGPx表達水平上調與動物對過氧化物轉化能力以及環境耐受能力的增強密切相關。對于生物個體而言，ROS生成是一種正常的生理現象。在正常狀態下，ROS生成后會被一系列的抗氧化酶迅速轉化和代謝，控制在較低的水平，以維持細胞氧化和還原狀態之間的平衡[6-7]。背角無齒蚌作為濾食性淡水生物，水體中氯酚類化合物很容易穿過細胞膜，并蓄積在體內，導致ROS生成顯著增多[9-10]。與此同時，機體也可以通過調整抗氧化酶的活性提高對ROS清除能力。在這些抗氧化酶體系中，SeGPx可以還原有機和無機過氧化物，能夠將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，保護細胞膜結構及功能不受過氧化物干擾和損害。哺乳動物和硬骨魚類可以通過提高SeGPx活性來減輕氧化應激的損傷[23]。經Cd和Cu等重金屬處理后，菲律賓蛤仔SeGPx表達水平顯著上調，提高對重金屬環境的耐受能力[15]。H2O2處理后盤鮑體內含硒谷胱甘肽過氧化物酶表達水平顯著升高，增強對氧化應激耐受能力[16]。高濃度Hg處理能夠抑制紫貽貝SeGPx活性，導致動物體內氧化作用和還原作用之間平衡發生偏移，使氧化作用占居主導地位，助推了Hg誘發氧化應激效應和遺傳毒性作用[14]。對于機體而言，SeGPx活性高低與丙二醛的含量密切關聯，丙二醛常作為衡量細胞膜脂質過氧化水平的關鍵指標。由此，2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP處理后AwSeGPx表達水平的升高，一方面反映了這3個化合物在高濃度條件下能夠導致背角無齒蚌體內脂質過氧化反應，導致包括細胞膜在內的脂質過氧化損傷；另一方面與動物對過氧化物的轉化能力和對環境的耐受能力有關。

本研究從背角無齒蚌中分離出AwSeGPxcDNA全基因序列，該序列具有SeGPx的標簽序列和保守序列。2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP處理后動物機體氧化應激水平增加，肝胰腺中AwSeGPx表達水平上調與動物提高過氧化物的還原能力和增強對環境的耐受能力有關。在相同濃度條件下，PCP對動物毒性和環境危害可能大于2,4-DCP和2,4,6-TCP。